一種高產β-淀粉酶的彎曲芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高產β-淀粉酶的彎曲芽孢桿菌及其應用,屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002]β _淀粉酶又稱為麥芽糖苷酶、糖原淀粉酶,其系統名為α _1,4_匍聚糖_4_麥芽糖水解酶(α -1, 4-Dglucan maltohydrolase),E.C.編號為 3.2.1.2.,作用于淀粉時,從其非還原性末端順次切下麥芽糖,水解產物是麥芽糖、極限糊精及非常少量的β -葡萄糖。β -淀粉酶具有相當大的工業應用價值,長期以來植物來源的大麥β -淀粉酶一直被廣泛用于多個領域。例如,在啤酒發酵業中部分代替大麥芽用于啤酒的生產,在食品業中用于水解淀粉制造麥芽糖漿和飴糖等。自1974年Higashihara等人首次確定巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)胞外淀粉酶含有淀粉酶以來,相繼發現了幾種能夠產生該酶的微生物,這些菌株大都屬于細菌,如蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、多粘芽孢桿菌(B.polymyxa)、環狀芽抱桿菌(B.circulans)、高溫放線菌(Thermeoactinomyces sp.)和熱硫梭菌(Clostridium thermosulfurogenes)等。與植物β -淀粉酶相比,微生物來源的β -淀粉酶具有便于大規模工業化生產的優點,因此篩選尋找理想的微生物β -淀粉酶源成為淀粉酶研究應用領域的一個重要目標。
【發明內容】
[0003]本發明的第一個目的是提供一種高產淀粉酶的彎曲芽孢桿菌(B.flexus),于2015年6月14號保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏編號為CCTCC N0:M2015368,保藏地址為中國武漢武漢大學。
[0004]所述彎曲芽孢桿菌,系從菜地土壤中分離得到的。
[0005]彎曲芽孢桿菌的篩選方法是從菜地土壤中經平板菌落特征初篩,采用一級發酵逐一搖瓶培養,得到的菌液離心取上清。取適量上清液加入到裝有15mL10%可溶性淀粉溶液的三角瓶中,在50°C水浴搖床中搖24h,所得產物經HPLC檢測發現以麥芽糖為主,則此酶為β-淀粉酶。經酶活測定,比較淀粉酶活性大小而得到產量較高的菌株。對該菌株進行16S rDNA鑒定,鑒定為彎曲芽孢桿菌。
[0006]本發明的第二個目的是提供一種利用所述彎曲芽孢桿菌生產β -淀粉酶的方法。
[0007]所述方法是以彎曲芽孢桿菌CCTCC Ν0:Μ2015368為生產菌株,經種子培養和液體深層發酵制得β -淀粉酶。
[0008]在本發明的一種實施方式中,所述液體深層發酵是在37°C、200rpm下發酵時間36h0
[0009]在本發明的一種實施方式中,所述液體深層發酵使用的發酵培養基含有:可溶性淀粉15g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、氯化鈉5g/L。
[0010]在本發明的一種實施方式中,所述種子培養是在溫度37°C、搖床轉速200rpm下培養時間為10-12h ;其中所用的種子培養基含有:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化鈉10g/L。
[0011]本發明還要求保護所述彎曲芽孢桿菌生產的β -淀粉酶及其應用,尤其是食品領域的應用。
[0012]本發明的有益效果:
[0013]本發明提供了一種高產β -淀粉酶的彎曲芽孢桿菌,β -淀粉酶活達到121U/mL。本發明菌株生產的β -淀粉酶的最適ΡΗ7.0、最適溫度為50°C、在50°C條件下半衰期可達26h0利用本發明的淀粉酶以10%馬鈴薯淀粉液化液為底物,在pH6.0,50°C條件下與普魯藍酶復配進行糖化,主要產物為麥芽糖和麥芽三糖,糖化24h麥芽糖轉化率超過75%,可用于高麥芽糖漿制備、啤酒等食品發酵行業。
[0014]生物材料保藏:
[0015]彎曲芽孢桿菌,分類學命名為彎曲芽孢桿菌FB-2014_6Bacillus flexusFB-2014-6,于2015年6月14日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC),保藏地址為武漢大學,保藏編號為CCTCC N0:M2015368o
【附圖說明】
[0016]圖1: β -淀粉酶最適pH值;
[0017]圖2: β -淀粉酶最適溫度;
[0018]圖3: β -淀粉酶熱穩定性;
[0019]圖4: β -淀粉酶糖化產物。
【具體實施方式】
[0020]一個β -淀粉酶酶活單位(1U)定義(U/mL):lmL酶液在ρΗ7.0,溫度50°C,lh水解可溶性淀粉生產lmg麥芽糖所需的酶量稱為一個酶活力單位。
[0021 ] 測定方法:準確吸取0.5mL2 %可溶性淀粉溶液,置于20mL比色管中,加
0.4mL50mMpH7.0磷酸鹽緩沖溶液,搖勻,于50°C水浴預熱5min,準確加入100 μ L酶液,立即計時,搖勾,于50°C水浴準確保溫酶解反應lOmin,立即加入DNS0.8mL,搖勻,并煮沸5min,冰水中冷卻。以同樣條件下用緩沖液代替酶液的反應體系作為對照,上述反應體系加10.2mL蒸餾水,混勾,lcm比色皿,540nm波長下測吸光度㈧。根據吸光度求得測試酶液的濃度。
[0022]β -淀粉酶酶活計算公式:X = (1.2736Α54。-0.0046) η
[0023]式中:
[0024]X—樣品的酶活力,U/mL ;
[0025]A54o一 540nm下吸光度之差;
[0026]η—樣品的稀釋倍數。
[0027]可溶性淀粉溶液(20g/L):稱取2.000g可溶性淀粉(以絕干計)于燒杯中,用少量水調成漿狀物,邊攪拌邊緩慢加入50mL沸水中,然后用水分次沖洗裝淀粉的燒杯,洗液倒入其中,攪拌并加熱至完全透明,用緩沖液冷卻定容至100mL。淀粉溶液現配現用。
[0028]50mM磷酸緩沖液(pH = 7.0):稱取17.6g十二水合磷酸氫二鈉和7.8g 二水合磷酸二氫鈉,分別用水溶解并定容至lOOOmL。取適量體積混合并用pH計校準至7.0后使用。
[0029]50mM Britton-Robinson Buffer Solut1n (伯瑞坦-羅比森緩沖溶液):在 100ml三酸混合液(磷酸、乙酸、硼酸,濃度均為0.04mol/L)中,加入適量體積的0.2mol/LNa0H,調至相應pH值。
[0030]實施例1:菌株篩選
[0031]按“五點取樣法”分別從無錫市濱湖區5處菜地土壤采取土樣10份,共30份土壤。從30份土樣中中分離目的菌株。將取得的土壤