一種降解柚皮苷的菌種及方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種葉桿菌，尤其是涉及其降解柚皮苷的方法。
【背景技術】
[0002] 柚皮苷（Naringenine-7-rhamnosidoglucoside)，又名柚戒、柑橘戒、異橙皮戒，是 蜜柚果皮中最主要的苦味物質。減少柚皮苷的含量，建立蜜柚果汁脫苦的產業化技術將給 飲料工業帶來重大的進步。近年來，微生物降解柚皮苷的方法越來越引起人們的重視，涉及 微生物的種類有真菌，細菌和酵母等，其中真菌生產柚苷酶來降解柚皮苷已經取得一定的 成果；而細菌降解柚皮苷的研究還較少。
[0003] 隨著蜜柚種植面積不斷擴大，蜜柚產量逐年上升，每年單是福建省的蜜柚產值就 達到6000萬噸，但是由于深加工技術研究滯后，尚未實現產業化的深加工，產供銷矛盾日 益突出，導致大量的果實被丟棄，丟棄果實腐爛的惡臭氣味又嚴重污染了環境。蜜柚榨汁是 蜜柚深加工的主要手段，但是獲得的鮮果汁具有明顯的苦味，需要除去柚皮苷，進行脫苦處 理后才能飲用。因此，如何有效降解柚皮苷成為一個緊迫的課題。
[0004] 目前蜜柚汁脫苦的主要方法有物理吸附法，食品添加劑方法和生物酶制劑等方 法。物理吸附法在吸附苦味物質的同時，也將吸附果汁中的營養成分，食品添加劑法只是 將苦味物質掩蔽，并沒有將其除去；而生物酶制劑法，中國專利201010219099. 6 (公開號 CN101897452A，公開時間2010年12月1日）公開了一種蜜柚果汁脫苦酶的發酵生產方法， 該方法需要對酶進行分離純化，此過程的成本較高。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種降解柚皮苷的菌種葉桿菌（Phyllobacteriumsp.) Wb51b〇
[0006] 所述菌種為葉桿菌（Phyllobacteriumsp. )Wb51b，從土壤樣品中篩選得到，已于 2012年保藏于中國普通微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為： 北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所），該保藏中心登記入冊編號為 CGMCCNo. 6472。
[0007] 本發明的另一個目的在于提供一種降解柚皮苷的方法。
[0008] 該方法利用葉桿菌（Phyllobacteriumsp.)降解柚皮苷。具體步驟包括：將葉桿 菌（Phyllobacteriumsp.)接種入含有柚皮苷的培養基，進行培養，并使用所培養的游離細 胞、進行固定化后的細胞或其混合形態，來降解柚皮苷。
[0009] 本發明采用上述館藏號為CGMCCNo.6472的葉桿菌降解柚皮苷。
[0010] 所述進行培養的初始pH值為3. 5~8. 5,優選3. 5~6. 5,更優選3. 0~5. 0。
[0011] 所述培養時間12小時~7天，優選24h~72h，更優選48h~72h。
[0012] 所述培養溫度優選25~50 °C，優選25~35 °C，更優選30~35 °C。
[0013] 可利用海藻酸鈉對細胞進行固定化。
[0014] 可重復利用固定化細胞降解柚皮苷。
[0015] 本發明的突出優點在于：
[0016] 1.本發明所用菌種為細菌，能夠高效降解柚皮苷，對營養要求簡單、易培養。
[0017] 2.本發明所用菌種無致病性，無生物安全性方面的隱患，可以直接應用于食品工 業，使用游離細胞降解柚皮苷，無需對相關的酶進行分離純化，可以降低成本。
[0018] 3.本發明可以使用海藻酸鈉固定化細胞來降解柚皮苷，可以多次重復利用。
【具體實施方式】
[0019] 本發明提供一種可降解柚皮苷的葉桿菌。
[0020] 本發明公開一種利用葉桿菌降解柚皮苷的方法。
[0021] 所述降解柚皮苷的具體步驟為：
[0022] 將葉桿菌（Phyllobacteriumsp.)CGMCCNo. 6472接種入含有柚皮苷的培養基中 進行培養，使用所培養的游離細胞或細胞進行固定化后降解柚皮苷，培養過程中測定其生 長情況和柚皮苷的降解情況。
[0023] 所述含有柚皮苷的培養基中，包含以下組分：柚皮苷、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸 鎂、氯化鈣。上述各組分的含量優選以下組合：柚皮苷含量〇. 1~50g/L，硫酸銨0. 05~2g/ L，磷酸氫二鉀0. 05~2g/L，硫酸鎂0. 05~2g/L，氯化鈣0. 05~2g/L。其中，柚皮苷含量 優選0. 1~5g/L，更優選0. 1~2g/L。
[0024] 所述進行培養的初始pH值為3. 5~8. 5,優選pH指為3. 5~6. 5,更優選3. 0~ 5. 0〇
[0025] 所述培養時間沒有特別限定，優選24h~72h，更優選48h~72h。培養時間太短， 則降解不夠徹底；培養時間太長，不經濟。
[0026] 所述培養溫度沒有特別限定，優選25~35°C，更優選30~35°C。培養溫度高，菌 體生長快，太高菌體會死亡，培養溫度低，菌體生長慢，太低菌體會死亡。
[0027] 所述方法可使用游離細胞降解柚皮苷。
[0028] 所述方法可使用固定化后的細胞降解柚皮苷。可使用的固定化材料沒有特別限 制，只要可實現對細胞的固定即可。
[0029]可重復利用固定化細胞降解柚皮苷。
[0030] 還可利用游離細胞和固定化細胞的混合形式降解柚皮苷。所述混合的比例和方法 沒有特別限制。
[0031] 在發酵培養過程中，可測定葉桿菌的生長情況和柚皮苷的降解情況。
[0032] 下面結合一些具體實施例做進一步描述。具體實施例為進一步詳細說明本發明， 非限定本發明的保護范圍。
[0033] 實施例1
[0034] (1)菌種的分離和純化
[0035] 取蜜柚果園新鮮土壤樣品lg加入到100mL的富集培養基中培養48h，取lmL富集 培養液轉入新的富集培養基中，連續富集培養3代。取富集培養液lmL，以10倍梯度進行 連續的稀釋，選擇合適稀釋度的菌懸液〇.2mL，于分離培養基中涂布，置于 30°C培養箱中培養72h后，挑取所有生長的菌株分別進行劃線分離培養。連續劃線分離培 養3代，獲得純化菌株。將這些純菌株轉移至液體培養基，30°C，150rpm，搖床培養，培養72h之后，按下述方法測定柚皮苷含量的變化情況：
[0036] 采用高效液相色譜法進行測定，條件為：流動相：乙腈：水=25 : 75 ;分析柱為： C18反相色譜柱；溫度：34°C;進樣量：20μL;流速：1.OmL/min;儀器為：安捷倫1200LC。
[0037] 菌株的分離和純化過程中所用培養基組成如下：
[0038] 富集培養基、分離培養基、液體培養基（g/L):柚皮苷2 ;硫酸銨1 ;磷酸氫二鉀1 ; 無水氯化鈣0. 2 ;硫酸鎂0. 5 ;pH4. 0~5. 0 ;0.IMPa滅菌20min。
[0039] (2)菌株鑒定
[0040] 將篩選得到的菌株Wb51b進行形態特征和16SrDNA序列鑒定，具體過程如下：
[0041] 菌株Wb51b為革蘭氏陰性桿菌，菌落邊緣呈白色，不規則星形；中部顏色較深，為 土黃色，圓形；中心呈橙黃色。菌落表面光滑且較濕潤，菌體容易挑離。
[0042] 菌株Wb51b的16SrDNA核苷酸序列如序列表所示。
[0043] 其與模式菌株Phyllobacteriumsp.的同源性最高，達到99. 92%。
[0044] 基于以上特征將步驟（1)篩選得到的菌株Wb51b鑒定為葉桿菌（Phyllobacterium sp. ) 〇
[0045] 實施例2
[0046] 生長曲線的測定及柚皮苷的降解。
[0047]菌種：Phyllobacteriumsp.Wb5lbCGMCCNo. 6472。
[0048] 培養基：
[0049] 種子培養基（g/L):葡萄糖1 ;酵母粉2 ;蛋白胨0. 5 ;柚皮苷0.