一種六堡茶渥堆過程中真菌菌群構成與菌種的獲取方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于六堡茶技術領域，尤其涉及一種六堡茶渥堆過程中真菌菌群構成與菌 種的獲取方法。
【背景技術】
[0002] 六堡茶是一種深度發酵的黑茶，具有紅、濃、陳、醇的風味特點，因原產于廣西梧州 市蒼梧縣的六堡鄉而得名，已有一千多年歷史，屬于我國地理標志產品。長期以來，人們認 為六堡茶的品質風味與其生產環境和參與發酵的微生物密切相關。然而，六堡茶中微生物 的構成與作用一直未見系統報導。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種六堡茶渥堆過程中真菌菌群構成與菌種的獲取方法， 旨在解決目前尚無研究表明六堡茶渥堆過程中的微生物數量及其生長變化情況如何，以及 不同堆層的數量差異如何，不利于更好的開發六堡茶價值的問題。
[0004] 本發明是這樣實現的，一種六堡茶渥堆過程中真菌菌群構成與菌種的獲取方法， 該六堡茶渥堆過程中真菌菌群構成與菌種的獲取方法得到了對六堡茶中真菌在渥堆過程 中數量變化情況，渥堆茶堆中，上層、中層、下層的微生物數量差異較大，第一次翻堆后，上 層微生物酵母、霉菌在全過程數量最大；中層的酵母、霉菌比上、下層的數量要少，酵母菌、 霉菌在第4天有1個數量小高峰，然后在第5天第一次翻堆前降低至發酵前的水平，酵母菌 和霉菌在第二次翻堆時達到全程的數量最高峰，達2. 2X10sCFU/g、1. 5X107CFU/g，之后均 降低至最終渥堆的l〇5CFU/g水平；
[0005] 得到了渥堆過程中的12種不同的真菌菌株：血紅密孔菌、茄病鐮刀菌、泡盛曲霉、 黑曲霉、塔賓曲霉、桔青霉、煙曲霉、赤散囊菌、雜色曲霉、阿姆斯特丹散囊菌、宛氏擬青霉、 酵母菌；
[0006] 六堡茶渥堆發酵過程中以曲霉屬真菌和酵母菌為主；六堡茶渥堆中的優勢微生物 為黑曲霉和酵母菌；黑曲霉和泡盛曲霉在降低水浸出物、茶多酸、游離氨基酸、可溶性糖類 和改變茶品的感官方面起的作用明顯。
[0007] 進一步，該六堡茶渥堆過程中真菌菌群構成與菌種的獲取方法具體包括以下步 驟：
[0008] 步驟一，進行六堡茶茶葉真菌DNA的提取、六堡茶茶葉中總DNA提取，然后進行總DNA擴增體系及程序，單個真菌DNA擴增體系及程序，梯度變性梯度凝膠電泳條帶擴增體系 及程序；
[0009] 步驟二，梯度變性梯度凝膠電泳圖譜的分析方法，梯度變性梯度凝膠電泳條帶回 收方法及序列分析，聚類分析方法，采用人工添加渥堆過程中分離的主要微生物到茶葉中， 模擬生產環境中的溫度、濕度變化，進行發酵；
[0010] 步驟三，茶葉添加菌種，在百級無菌室中，將菌液混勻至880mL滅菌蒸餾水中，振 蕩混勻，再均勻加至茶葉中，然后裝簍，稍微用力緊壓，然后用無菌大塑料袋套住；
[0011] 步驟四，發酵培養，在發酵過程采用生化培養箱輔助升降溫，根據生產中溫度的變 化規律調節，使與生產一致，同時，在生化培養箱中放置有水燒杯以保持濕度，發酵時間與 生產一致，為35天；
[0012] 步驟五，對發酵后茶葉進行水分的檢測、水浸出物的檢測、葉茶多酚的檢測、游離 氨基酸的檢測和可溶性糖的檢測。
[0013] 進一步，真菌DNA的提取方法具體包括：從真菌計數中的培養平板，選取生長形 態不同的菌株，轉移至孟加拉紅培養基進行純培養，待長滿培養基表面時，刮取適量菌體至 無菌研缽，倒進液氮，用力研磨，反復直至粉末狀，取豆粒大粉末轉移至1. 5mL離心管，加入 900μL的真菌DNA提取液，同時加入450μL的氯仿、450μL的Tris-平衡酚，輕輕上下顛 倒混勾，lOOOOrpm離心lOmin，取800μL上清轉移至另1滅菌離心管中，加入等量的氯仿， 上下顛倒混勾后，l〇〇〇〇rpm離心10min，取600yL上清，加入等量的異丙醇沉淀，13000rpm, 離心15min，收集的DNA用75%酒精洗滌2遍，加入約30μL的ddH20溶解，置-20°C保存。
[0014] 進一步，茶葉中總DNA提取方法，從混勻的茶葉里稱量至50g，置于500mL的錐形瓶 里面，加用滅菌的玻璃珠，再添加0. 85%磷酸鹽緩沖液450mL，200rpm震蕩15min，然后用雙 層紗布過濾掉茶葉，濾液使用500mL的離心瓶收集，lOOOOrpm離心10min，收集沉淀；
[0015] 采用液氮研磨的方式裂解菌體，將沉淀從離心瓶轉移至滅菌的研缽，倒進液氮，用 力研磨，反復直至粉末狀，轉移粉末至50mL離心管，加入15mL的總DNA提取液，同時加入 7. 5mL的氯仿、7. 5mL的Tris-平衡酸，上下顛倒混勾，lOOOOrpm離心10min，取上清轉移至 另1新離心管中，加入等量的氯仿，上下顛倒混勾后，l〇〇〇〇rpm離心10min，取上清，加入等 量的異丙醇沉淀，13000印111，離心151^11，收集的0嫩用75%酒精洗滌2遍，加入0.31^的 ddH20溶解，置-20°C保存。
[0016] 進一步，梯度變性梯度凝膠電泳操作步驟：
[0017] 點樣：凝膠聚合好后拔掉梳子，用1XTAE清洗膠孔，組裝膠板到中心電極后，放入 裝有電泳緩沖液的電泳槽，加350mL1XTAE到上層緩沖液室，蓋上蓋子，取下上樣蓋，即上 樣，將制備好的樣品與等體積的梯度變性梯度凝膠電泳上樣緩沖液混勻，用移液器將樣品 加到膠孔；
[0018] 電泳：先將電泳緩沖液預熱至60°C，中心電極放入電泳槽并加樣后，蓋上加樣蓋， 打開緩沖液栗開關，調電壓至180V電泳6h;
[0019] 梯度變性梯度凝膠圖譜的分析方法：
[0020] 變性梯度凝膠電泳后的圖譜采用BI0-RAD的圖像分析軟件QuantityOne進行分 析；
[0021] 梯度變性梯度凝膠條帶回收方法及序列分析：
[0022] 電泳完后用于回收條帶的聚丙烯酰胺凝膠用GelRed染料染色，步驟如下：
[0023]GelRed染料染色30min，去離子水漂洗10s，在紫外燈下用無菌手術刀片切下含 有目的片段的膠塊，裝入1. 5mLEP管中；
[0024] 用滅菌槍頭將凝膠搗碎，加20μL滅菌雙蒸水，放置4°C冰箱過夜；
[0025] 12000rpm離心10min，取1μL上清為模板，用相應特異性引物PCR擴增目的DNA 片段；回收的條帶用無GC夾板的引物擴增后，送基因公司測序；
[0026] 聚類分析方法，目的條帶測序后，在RDP數據庫中用Classifier軟件包對序列 進行歸類，并在GeneBank進行序列同源性比較，序列和所比對的同源性高的序列一起，用MEGA5. Obeta軟件構建系統進化樹，系統進化樹的構建方法用距離矩陣法中的鄰接法。 [0027] 進一步，待發酵茶葉的前處理包括：
[0028] 對實驗室內的茶葉，首先將所有的茶葉混合，等分為4份，每份6kg，采用高溫滅菌 的方式殺滅茶葉中的微生物，成無菌的狀態，同時對裝壓茶葉的竹簍進行殺菌，殺菌溫度時 間為 0· 1MPA30min;
[0029] 發酵用菌種的前處理，將分離得到的菌種接種于PDA培養基上進行純培養，待長 滿培養基后，使用滅菌棉簽將其轉移至10mL的0. 85 %的磷酸鹽緩沖液中，濃度均為0. 5的 麥氏比濁度。
[0030] 進一步，發酵后茶樣的制備：將渥堆后的茶葉放緊恒溫干燥箱，50°C烘至塑料袋上 的水氣消失，然后用均質器將其碎，過40目篩，放置于磨沙口瓶備用。
[0031] 進一步，發酵后茶葉水分檢測：
[0032] 稱量5g粉碎后茶粉于水分測定儀的鋁皿中，設定烘干溫度為105°C，設備自動運 行得出茶葉的水分含量；
[0033] 發酵后茶葉水浸出物的檢測：
[0034] 稱量2g茶粉，精確至0· OOOlg，置于500mL燒瓶中，加入2000mL蒸餾水，水浴加熱， 緩緩回流，同時不停旋轉燒瓶，時間為lh，冷卻至室溫，然后無損轉移入500mL容量瓶，蒸 餾水稀釋至刻度，充分混勻，并通過慢性濾紙，濾液備用，取50mL濾液于蒸發皿中，水浴鍋 上蒸發至干，然后轉移至全自動水分測定儀，l〇5°C干燥，稱量，直至恒重：
[0035] 茶葉水浸出物干態質量百分率（X)計算公式如下：
[0036]
[0037]式中：
[0038] G1:為蒸發皿重量；
[0039] G2:為烘干后殘渣和蒸發皿重量；
[0040] G :為茶葉重量；
[0041]Μ:為茶葉干物質含量百分比。
[0042] 進一步，發酵后茶葉茶多酚的檢測：稱量0. 2g茶粉，精確至0. 0001g，于離心管中， 加入70%甲醇溶液511^，70°(：預熱；用玻璃棒充分攪拌混勻，轉移至70°(：水浴，浸提101^11， 每5min攪拌一次，浸提后冷卻至室溫，轉移至離心機3500rpm離心10min，轉移上清至10mL 容量瓶，殘渣再用5mL甲醇重復上述操作提取一次，合并提取液，定容至10mL，過0. 45μm 濾膜，制成母液待用，用移液器移取2mL母液至10mL的容量瓶中，用穩定溶液定容至10mL， 過0.45μm濾膜待測，移取沒食子酸工作液、蒸餾水、測試液各lmL于刻度試管內，每管加 5.OmL的福林酚試劑，搖勻，反應3-8min，加入4.OmL7. 5%似20)3溶液，加蒸餾水定容至刻 度，搖勻，室溫下放置60min，用10_比色皿于分光光度計測定吸光度A，波長為765nm，根據 沒食子酸工作液的吸光度與各工作溶液的沒食子酸濃度，制作標準取線；
[0043] 比較試樣和標準工作液的吸光度，按以下公式計算：
[0044]
[0045]式中：
[0046]A:樣品測試液吸光度；
[0047]V:樣品提取液體積，1 OmL;
[0048] D :稀釋因子；
[0049] SL0PEstd:沒食子酸標準曲線斜率；
[0050] Μ:樣品干物質含量（％ );
[0051] m1:樣品質量，（g)。
[0052] 進一步，發酵后茶葉游離氨基酸的檢測：吸取lmL的茶湯，轉入25mL的容量瓶中， 加入0.511^的？!18.0的磷酸鹽緩沖液和0.2%的茚三酮溶液，在沸水浴中加熱151^11，冷卻 至室溫，加蒸餾水定容至25mL，放置lOmin后，用5nm比色杯，以試劑空白液作對照，570nm 波長，測定吸光度；
[0053] 制作氨基酸標準曲線，吸取0. 0、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5、3.OmL氨基酸標準溶液，于一 組25mL的容量瓶中，加蒸餾水4mL、pH8. 0的磷酸鹽緩沖液0. 5mL，2 %的茚三酮溶液0. 5mL， 沸水浴中加15min，測定吸光度，將測得的吸光度與對應的茶氨酸或者谷氨酸濃度繪制標準 曲線；
[0054] 計算公式：
[0055]
[0056]式中：
[0057]L1:茶湯總量，（mL);
[0058] L2:測定用茶湯總量，（mL);
[0059] Μ。:茶葉用量，（g);
[0060] Μ:試樣十物質含量，（％ );
[0061] C:根據測定的吸光度從標準曲線上查得的茶氨酸或谷氨酸的毫