抗egfr蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞及其產生的抗egfr單克隆抗體和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，特別涉及抗EGFR蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞及其產 生的抗EGFR單克隆抗體和應用。
【背景技術】
[0002] 表皮生長因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)屬于I-型受體 酪氨酸激酶（receptortyrosinekinase,RTK)家族的成員，主要表達于上皮細胞的細胞質 膜上。當EGFR與其配體結合后，會發生二聚化，從而被激活。激活的EGFR通過細胞信號轉 導途徑促進細胞生長與迀移。因而EGFR信號通路的過度活化與腫瘤的發生有著密切的關 系。已有研究發現，多種腫瘤的發生與EGFR受體的過量表達相關。
[0003] 目前臨床上主要通過免疫組織化學（IHC)病理實驗檢測腫瘤細胞中EGFR蛋白的 表達狀況。IHC實驗的核心為特異性結合EGFR蛋白的單克隆抗體，其性能的優劣直接決定 著整個檢測的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結合特異性較高的針對EGFR蛋白的單克 隆抗體具有重要的意義。
【發明內容】
[0004] 有鑒于此，本發明提供抗EGFR蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞及其產生的抗EGFR單 克隆抗體和應用。本發明所述單克隆抗體可與EGFR蛋白特異性結合，而與細胞內其他蛋白 無交叉反應，顯著提高了EGFR蛋白免疫檢測的特異性、準確性和可靠性，真實反映腫瘤細 胞內EGFR蛋白表達水平，可應用于肺癌、胃癌、結直腸癌、卵巢癌、肝細胞癌中EGFR蛋白表 達水平的檢測。
[0005] 為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
[0006] 本發明提供了一種單克隆抗體，其與表皮生長因子受體（EGFR)蛋白特異性結合。
[0007] 在本發明的一些具體實施方案中，所述單克隆抗體由保藏編號為CGMCCNo. 11082 的雜交瘤細胞株產生。
[0008] 本發明還提供了所述單克隆抗體在制備用于檢測表皮生長因子受體（EGFR)蛋白 的免疫檢測工具中的應用。
[0009] 在本發明的一些具體實施方案中，所述免疫檢測工具為試劑、試劑盒、芯片或試 紙。
[0010] 本發明還提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括所述單克隆抗體。
[0011] 本發明還提供了所述單克隆抗體在制備用于標記組織細胞的試劑或試劑盒中的 應用。
[0012] 在本發明的一些具體實施方案中，所述單克隆抗體在制備用于標記組織細胞的試 劑或試劑盒中的應用中所述組織細胞選自肺癌、胃癌、結直腸癌、卵巢癌、肝細胞癌或相關 腫瘤。所述相關腫瘤為與上述組織、細胞相同的腫瘤。
[0013] 本發明還提供了一種標記組織細胞的試劑盒，包括所述單克隆抗體。
[0014] 在本發明的一些具體實施方案中，所述標記組織細胞的試劑盒中所述組織細胞選 自肺癌、胃癌、結直腸癌、卵巢癌、肝細胞癌或相關腫瘤。所述相關腫瘤為與上述組織、細胞 相同的腫瘤。
[0015] 本發明還提供了一種雜交瘤細胞株，其保藏編號為CGMCCNo. 11082。
[0016] 與現有技術相比，本發明提供了一種雜交瘤細胞株（保藏編號為CGMCC No. 11082)，以及由此雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體Umab95。本發明還提供了單克隆抗體 Umab95在制備用于檢測EGFR蛋白的免疫檢測工具中的應用，含單克隆抗體Umab95的免疫 組化試劑盒，以及單克隆抗體Umab95在制備用于標記腫瘤的試劑盒中的應用。本發明所述 單克隆抗體可與EGFR蛋白特異性結合，而與細胞內其他蛋白無交叉反應，顯著提高了EGFR 蛋白免疫檢測的特異性、準確性和可靠性，真實反映腫瘤細胞內EGFR蛋白表達水平，可應 用于肺癌、胃癌、結直腸癌、卵巢癌、肝細胞癌組織中EGFR蛋白表達水平的檢測。
[0017] 生物保藏說明
[0018] 用于保藏的雜交瘤細胞株UMAB95的分類命名為：表皮生長因子受體（EGFR)單克 隆抗體雜交瘤細胞株；
[0019] 保藏單位全稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
[0020] 保藏單位簡稱：CGMCC;
[0021] 保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；
[0022] 保藏日期：2015年07月03日；
[0023]保藏編號：CGMCCNo. 11082。
【附圖說明】
[0024] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0025] 圖1示實施例1克隆位點設計如圖，其中底紋部分為0RF區；
[0026] 圖2示實施例2重組EGFR蛋白Westernblot檢測結果圖，以anti-DDK檢測重組 EGFR蛋白在HEK293T細胞中的表達，其中泳道L為轉染空載體的HEK293T細胞裂解液為抗 原的檢測結果、泳道R為轉染pCMV6-rEGFR質粒的HEK293T細胞裂解液抗原的檢測結果；
[0027] 圖3示實施例2重組EGFR蛋白SDS-PAGE結果圖；用抗DDK親和層析柱純化重組 EGFR蛋白，純化后的蛋白通過SDS-PAGE膠電脈、考馬斯亮藍染色；
[0028] 圖4示實施例3以單克隆抗體Umab95識別不同腫瘤細胞系內源EGFR蛋白的 Westernblot檢測結果圖。從左至右分別為：!fepG2，HeLa，SVT2，A549，C0S7，Jurkat，MDCK， PC12,MCF7 ；
[0029] 圖5示實施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人前列腺組織免疫組化結果圖（一抗 為EGFR單克隆抗體Umab95);
[0030] 圖6示實施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人膀胱癌組織免疫組化結果圖（一抗 為EGFR單克隆抗體Umab95);
[0031] 圖-7示實施例50riGene蛋白芯片鑒定結果圖（一抗為EGFR單抗Umab95，l:100 ; 二抗為DyLight649-conjugatedAffiniPureFragmentGoat-anti-MouseIgG，1:400)。
【具體實施方式】
[0032] 本發明公開了抗EGFR蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞及其產生的抗EGFR單克隆抗體 和應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是， 所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發 明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發 明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應 用本發明技術。
[0033] 本發明提供了一種雜交瘤細胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心（簡稱為CGMCC)，保藏日期為2015年07月03日，保藏編號為CGMCCNo. 11082。
[0034] 本發明還提供了一種特異性結合EGFR蛋白的單克隆抗體Umab95,由上述雜交瘤 細胞株產生。
[0035] 本發明所述單克隆抗體的制備方法如下：
[0036] (1)重組表達載體的構建：根據EGFR0RF核苷酸序列（EGFR0RF核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示，1215bp;EGFR氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示）
[0037] 設計引物PCR擴增EGFR0RF第lbp位到第1215bp位序列，基因兩側分別引入 限制性內切酶位點Sgfl和Mlul，插入表達載體pCMV6-Entry，構建EGFR的重組表達質粒 pCMV6-rEGFR;上游擴增引物序列，SEQIDNO. 3:CACGCGATCGCATGCGACCCTCCGGGACGGCC:下 游擴增引物序列SEQIDNO. 4:ACCGACGCGTGGCCGTCCCGGAGGGTCGCAT
[0038] (2)EGFR重組蛋白的表達與純化：將EGFR重組表達質粒轉化HEK293T細胞，裂