抗人神經纖毛蛋白1的單域抗體及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程和抗體工程技術領域，涉及一種抗人神經纖毛蛋白1的抗 體，尤其是涉及一種抗人神經纖毛蛋白1的單域抗體及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 目前已有多種單克隆抗體應用于一些惡性腫瘤的臨床治療，但是抗體藥物在治 療應用中仍然存在不少局限。首先，完整抗體本身分子量比較大，不易穿透達到實體瘤 內部。其次，單克隆抗體的免疫原性強，在治療過程中存在毒副作用，如鼠源性的單抗 在人體內反復使用可誘發人抗鼠抗體（Humananti-murineantibody，HAMA)反應。再 者，完整抗體Fc段的存在可使其與體內具有Fc受體的非特異組織細胞結合，影響其靶 向效果。另外，單克隆抗體規模化生產耗時長，抗血清規模化生產不能保證市場需求而 且質量不穩定。因此，研究相關特異性強、免疫原性低、可規模化生產的抗體具有重要 意義（1.甄永蘇，紹榮光主編.抗體工程藥物[M].北京：化學工業出版社，2002.)。而 小型化抗體能克服上述不足，目前已經成功構建的小分子抗體主要有以下幾種形式：抗 原結合片段（antigenbindingfragment，Fab)、單鏈抗體（single-chainvariable fragment，scFv)、單域抗體（single-domainantibody，sdAb)等。（2.HoiligerP,Hudson PJ.Engineeredantibodyfragmentsandtheriseofsingledomains[J].Nat Biotechnol, 2005, 23(9) : 1126-1136 ；3.ZhangJB,LiQG,NguyenTD,etal.Apentavalent single-domainantibodyapproachtotumorantigendiscoveryandthedevelopment ofnovelproteomicsreagents[J].JMolBiol, 2004, 341:161 - 169 ；4.Hudson PJ,KorttAA.HighavidityscFvmultimers,diabodiesandtriabodies[J].JImmunol Methods, 1999, 231:177 - 190 ；5.TodorovskaA,RooversRC,Dolezal0,etal.Designand applicationofdiabodies,triabodiesandtetrabodiesforcancertargeting[J].J ImmunolMethods, 2001, 248:47 - 66.)其中單域抗體僅由重鏈可變區（VH)或輕鏈可變區 (\)構成，分子量約為完整抗體的1/12,具有結構單一、免疫原性低、穿透力強、特異性和親 和力高、穩定性好、易克隆、高表達、便于純化等諸多優點。因此，單域抗體適合進行商品化 大規模生產，可作為生物傳感器診斷用靶標試劑，可用于構建免疫融合物進行靶向治療，應 用于臨床可減少治療過程中的毒副作用。總之，單域抗體作為一種小型化的基因工程抗體， 獨特的理化和生物學特性使其在基礎研究、藥物開發和疾病診斷治療等領域具有廣闊的應 用前景。
[0003] 神經纖毛蛋白1 (Neuropilin-ι，簡稱NRP-1)是細胞表面的I型跨膜糖蛋白，其相 對分子質量為130kDa，由位于染色體10pl2的基因編碼。NRP-1基因的開放閱讀框由17個外 顯子和 16個內含子組成（6.RossignolM,GagnonML,KlagsbrunM.Genomicorganization ofhumanneuropilin-landneuropilin-2genes:identificationanddistributionof splicevariantsandsolubleisoforms[J] ·Genomics, 2000, 70:211-222.) 〇NRP-1 在 脊椎動物中高度保守，由胞內區、跨膜區和胞外區三部分組成，其中胞外段包括860個氨基 酸，由3個不同的結構域組成，分別稱為ala2結構域、blb2結構域和c結構域。ala2結構 域位于第27個到第264個氨基酸，又稱為CUB結構域，blb2結構域位于第274個到第583 個氨基酸，其與凝血因子V和VIII的結構相似且同源，c結構域位于第650個到803個氨 基酸，其中部含有MAM結構域。NRP-1胞外段的3個結構域能與不同的分子結合，介導不同 的信號傳導。近年來的研究表明，作為多功能共受體的NRP-1參與血管內皮生長因子、肝細 胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、胎盤生長因子、血小板衍生生長因子等多種生長因 子的信號傳遞，在血管生成、發育以及腫瘤的生長、轉移等過程中起著重要作用，與腫瘤的 進展和預后等密切相關，提示NRP-1可作為惡性腫瘤診斷和預后的靶點。（7.S.Rizzolio andL.Tamagnone.Multifacetedroleofneuropilinsincancer[J].CurrentMedicinal Chemistry,2011, 18:3563 - 3575 ；8.CamilleGrandclementandChristopheBorg. Neuropilins:ANewTargetforCancerTherapy[J].Cancers,2011,3:1899 - 1928 ； 9.AdrianMJubb,LauraAStrickland,ScotDLiu,etal.Neuropilin-lexpressionin canceranddevelopment[J].JPathol，2012, 226:50 - 60.)另一方面，越來越多的研究人 員采用不同的方法和技術手段靶向NRP-1進行了腫瘤的治療研究。如針對NRP-1的siRNA， 多肽，可溶性NRPs拮抗劑，以及單克隆抗體等。這些臨床前研究結果顯示，阻斷NRP-1能通 過抑制血管生成以及在某些腫瘤模型中通過直接抑制腫瘤細胞增殖的方式抑制腫瘤的生 長。表明NRP-1能作為一個重要的有效靶點用于抗血管生成和抗腫瘤治療研究以及潛在 的臨床應用（10.PanQ,ChantheryY，LiangWC,etal.Blockingneuropilin-1function hasanadditiveeffectwithanti-VEGFtoinhibittumorgrowth[J].Cancer Cell，2007, 11:53-67 ;11.GrandclementC，BorgC.Neuropilins:anewtargetfor cancertherapy[J].Cancers, 2011, 3:1899-928.)〇
[0004] 基于抗體針對腫瘤相關靶點的靶向策略在腫瘤的診斷和治療中發揮著重要作 用。美國genentech公司制備了針對NRP-1的高親和性單克隆抗體anti-NRPlA(革巴 向NRP-lala2結構域）和anti-NRPlB(靶向NRP-lblb2結構域），研究報道表明， 這兩種抗NRP-1單抗抑制VEGF刺激引起的HUVEC細胞迀移和腫瘤模型中腫瘤的形 成。（12.Liangff-C,DennisMS,StawickiS,etal.Functionblockingantibodies toneuropilin-1generatedfromadesignedhumansyntheticantibodyphage library[J]·JournalofMolecularBiology, 2007, 366:815-29.)然后，他們發現抗NRP-1 單抗能阻斷VEGF與NRP-1的結合，而且能與抗VEGF治療協同抑制腫瘤的生長。（10.Pan Q,ChantheryY,LiangWC,etal.Blockingneuropilin-1functionhasanadditive effectwithanti-VEGFtoinhibittumorgrowth[J].CancerCell, 2007, 11:53-67.) 在此基礎上，genentech公司開發了一種完全人源化的NRP-1單抗MNRP1685A，且通過 采用單獨的MNRP1685A或與貝伐單抗（+紫杉醇）聯合應用治療進展期實體瘤的方案 完成了I期臨床試驗。（11.GrandclementC，BorgC.Neuropilins:anewtargetfor cancertherapy[J].Cancers，2011，3:1899-928.)鑒于NRP-1 在惡性腫瘤發生發展過程 中的重要作用，本申請人也自主通過基因工程技術結合雜交瘤的方法篩選獲得了能與人 NRP-1b1b2結構域高親和特異性結合的鼠抗人NRP-1單克隆抗體，一系列的研究數據表 明，該單抗在多種腫瘤模型中發揮抑制腫瘤細胞生長、粘附、迀移、侵襲、腫瘤血管生成以 及移植瘤生長等多種抗腫瘤效應（13.LiX，LuoF,WangS，etal·Monoclonalantibody againstNRP-lblb2[J].Hybridoma, 2011, 30:369-373 ； 14.ChenL,Miaoff,TangX,et al.Inhibitoryeffectofneuropilin-lmonoclonalantibody(NRP-lMAb)onglioma tumorinmice[J].JournalofBiomedicalNanotechnology, 2013, 9:551-558 ；15.Zeng F,LuoF,LvS,etal.Amonoclonalantibodytargetingneuropilin-1inhibits adhesionofMCF7breastcancercellstofibronectinbysuppressingtheFAK/ pl30cassignalingpathway[J] ·Antican