一種來源于羊草與抗寒相關的蛋白及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，涉及一種來源于羊草與抗寒相關的蛋白及其編碼基因 與應用。
【背景技術】
[0002] 春、秋、冬季節，寒冷地區的植物經常處于零度以下的環境中，從而需要一系列分 子和生理上的適應，以減輕凍害對自身造成的損傷。面對全球氣溫升高導致的暖冬和極端 惡劣天氣的頻繁交替出現，全球每年因低溫凍害對農作物造成的損失高達數千億元。因此， 加強植物特別是在農業、畜牧業等方面有重要利用價值的植物（如農作物、牧草等）的抗寒 基因挖掘，并利用轉基因技術將優質的抗寒基因資源用于改良重要農作物與畜牧草的抗寒 能力，是當前我國及世界農業與畜牧業所正在面對的重大問題與挑戰。
[0003] 植物一般能耐零下短時低溫影響的特性稱為抗寒性，這一特性是植物在漫長的演 化過程中對逆境環境不斷適應的結果。植物的耐寒性涉及復雜的分子機制與生理生化過 程，其中前者主要包括了ΑΒΑ依賴、ΑΒΑ不依賴共2種途徑，后者則包括膜系統（質膜的"膜 質相變")、抗氧化系統（SOD，POD，CAT等）、細胞滲透調節物質（可溶性糖、脯氨酸等）和植 物生長調節物質（ABA，GA等）等多方面的適應過程。盡管多年來人們對植物響應低溫脅迫 的過程機制進行大量研究，但由于植物本身應對外界環境變化的響應機制十分復雜，使得 植物在響應低溫方面的許多重要問題仍需進一步探索。同時，由于植物在抗逆機制方面存 在很多相互交叉的途徑，其復雜性使得利用傳統雜交育種方法很難得到抗寒性特異增強的 品種。此外，對于優質抗寒基因的篩選獲得也成為阻礙當前植物耐低溫基因工程大規模應 用的重要因素。
[0004] 近年，隨著高通量測序技術的快速發展與廣泛應用，人們開始不斷利用高通量測 序技術對特定脅迫處理的植物材料進行測序分析，以得到與特定脅迫處理密切相關的差異 表達基因，從而為發現脅迫應答途徑中的新基因開拓了新的途徑。隨著對耐低溫新基因的 持續發掘和進一步的功能驗證，人們對于植物耐寒機制的了解得以拓展。隨著現代基因工 程技術的持續進步，利用轉基因技術改良植物的抗寒性，對于維護未來農業與畜牧業的高 產穩產和可持續發展具有重要意義。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種與植物抗寒性相關的蛋白及其編碼基因和應用。
[0006] 本發明所提供的蛋白質，名稱為Lc3919,來源于羊草（Leymuschinensis(Trin.) Tzvel·)，是如下（a)或（b):
[0007] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0008] (b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與植物耐冷性相關的由序列1衍生的蛋白質。
[0009] 其中，序列表中序列1由198個氨基酸殘基組成。
[0010] 為了便于Lc3919蛋白的純化，可在由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋 白質的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標簽。
[0011] 表：標簽的序列
[0012]
[0013] 上述（b)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。 上述（b)中的蛋白質的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾 個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變。
[0014] 編碼所述1x3919蛋白的核酸分子也屬于本發明的保護范圍。
[0015] 所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可以 是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
[0016] 在本發明的一個實施例中，所述核酸分子具體為編碼所述Lc3919蛋白的基因（命 名為Lc3919);所述Lc3919基因是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
[0017] 1)編碼序列為序列表中序列2自5'末端第101至697位核苷酸所示的DNA分子；
[0018] 2)序列表中序列2的第1-907位所示的DNA分子；
[0019] 3)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0020] 4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA分子雜交且編碼所述Lc3919蛋白的 DNA分子；
[0021] 5)與1)或2)或3)或4)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼所述Lc3919 蛋白的DNA分子。
[0022] 上述嚴格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0· 1 %SDS和 1XSSC，0· 1 %SDS各洗膜一次。
[0023] 其中，序列2由967個核苷酸組成，第101-697位為編碼序列，編碼序列表中序列 1所示的蛋白質。
[0024] 含有上述核酸分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的 保護范圍。
[0025] 所述重組載體可為重組表達載體，也可為重組克隆載體。
[0026] 所述重組表達載體可用現有的植物表達載體構建。所述植物表達載體包括雙元 農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、 ?81121、？8丨1119、？041^142301、？041^141301-1]1^~或其它衍生植物表達載體。所述植物表達 載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加 工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端。使 用所述基因構建重組表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、 組織特異型或誘導型啟動子，例如花椰菜花葉病毒（CAMV)35S啟動子、泛素基因Ubiquitin 啟動子（pUbi)、脅迫誘導型啟動子rd29A等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合 使用；此外，使用本發明的基因構建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或 轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與 編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的 來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結 構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用重組表達載體進行 加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因、具有抗性 的抗生素標記物或是抗化學試劑標記基因等。也可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境 篩選轉化植株。
[0027] 在本發明中，所述重組表達載體中啟動所述Lc3919基因轉錄的啟動子可為35S啟 動子，如花椰菜花葉病毒（CAMV)35S啟動子。
[0028] 更為具體的，所述重組表達載體可為如下兩種中的任一種：
[0029] (1)在pMDC45載體的重組位點attRl和attR2間插入所述Lc3919基因得到的重 組質粒。
[0030] (2)在pK7WG2D載體的重組位點attRl和attR2間插入所述Lc3919基因得到的重 組質粒。
[0031] 所述表達盒由能夠啟動所述Lc3919基因表達的啟動子，所述Lc3919基因，以及轉 錄終止序列組成。
[0032] 所述Lc3919蛋白，或所述核酸分子，或所述重組表達載體、表達盒或重組菌在如 下（al)或（a2)中的應用也屬于本發明的保護范圍：
[0033] (al)調控植物的抗寒性；
[0034] (a2)選育抗寒性提高的植物品種。
[0035] 在本發明的一個實施例中，所述調控植株抗寒性具體為提高植物的抗寒性。
[0036] 所述選育抗寒性提高的植物品種的方法，具體可包括如下步驟：將所述Lc3919蛋 白表達量較高的植株作為親本進行雜交，從雜交后代中獲得抗寒性高于親本的植株。
[0037] 本發明的另一個目的是提供一種培育抗寒性提高的轉基因植物的方法。
[0038] 該方法包括將編碼所述Lc3919蛋白的基因導入目的植物中得到轉基因植物的步 驟；所述轉基因植物與所述目的植物相比，抗寒性提高。
[0039] 所述Lc3919蛋白在所述轉基因植物中的表達量高于所述目的植物；編碼所述 Lc3919蛋白的基因（即Lc3919基因）是所述基因是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
[0040] 1)編碼序列為序列表中序列2自5'末端第101至697位核苷酸所示的DNA分子；
[0041] 2)序列表中序列2的第1-907位所示的DNA分子；
[0042] 3)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0043] 4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA分子雜交且編碼所述Lc3919蛋白的 DNA分子；
[0044]5)與1)或2)或3)或4)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼所述Lc3919 蛋白的DNA分子。
[0045] 上述嚴格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0· 1 %SDS和 1XSSC，0· 1 %SDS各洗膜一次。
[0046] 所述Lc3919基因具體可通過上述任一所述重組表達載體導入所述目的植物中， 得到所述轉基因植物。具體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯 微注射、電導、農桿菌介導、基因槍等常規生物學方法將所述重組表達載體轉化植物細胞或 組織，并將轉化的植物組織培育成植株。
[0047] 所述植物可為雙子葉植物，也可為單子葉植物，所述雙子葉植株如擬南芥。
[0048] 在本發明中，以上的所述抗寒體現為抗_8°C脅迫處理12小時。
[0049] 在本發明的一個實施例中，所述植物具體為擬南芥品種哥倫比亞（Col-Ο)。
[0050] 擴增所述Lc3919基因全長或其任一片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。
[0051] 在本發明的一個實施例中，所述引物對具體為如下：
[0052] 5, -ATCCTTGCTCCAGAGTCCAGATAAT-3,；
[0053] 5' -TTGAGATAGTTCACCACTG-3'。
[0054] 本發明所提供的Lc3919可以調控植物抗寒冷脅迫能力，受低溫脅迫誘導，可以參 與羊草對低溫脅迫的響應，提高植物的抗冷，Lc3919及其編碼基因對于培育抗寒性提高的 羊草及其他植物新品種具有重要實用價性。實驗顯示，經_8°C過夜寒冷脅迫后野生型擬南 芥植株存