一種熒光分子探針及其在檢測糖類物質中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種熒光分子探針，特別是一種以芘為熒光團的染料分子探針，該熒 光分子探針對水溶性糖，特別是煙草中的水溶性總糖具有較好的檢測性能。
【背景技術】
[0002] 煙草中的水溶性總糖包括具有還原性的葡萄糖、果糖、在測定條件下能水解為還 原性單糖的蔗糖（水解后為1分子葡萄糖和1分子果糖）、麥芽糖（水解為2分子葡萄糖）。 煙草燃吸時，水溶性總糖高溫裂解成低級的醛、酮和弱酸性（pH5. 3~6. 5)物質，對煙氣的 香氣和吃味都有正面影響，并能減少煙氣的刺激性，因此水溶性總糖是決定煙葉品質的重 要化學成分。
[0003] 最經典的總糖測定方法是費林試劑法以及由此發展出的銅還原滴定-芒森?沃克 法，即通過測定被費林試劑還原的銅的量，查表獲得對應的葡萄糖量，計算得出試樣的還原 糖（或水溶性總糖）含量。費林試劑比色法是對芒森?沃克法的改進，免去對還原銅的滴 定，直接測定費林試劑生成的酒石酸鉀鈉銅（590nm)的吸光度，得到還原銅的含量。同樣利 用氧化還原反應，3, 5-二硝基水楊酸比色法（DNS)也是目前常用的方法，具有簡便快捷易 操作的特點，但穩定性差，易受提取液中其他物質如色素、蛋白質等的干擾。目前煙草行業 標準采用連續流動分析儀測定水溶性糖，其原理是用5%乙酸的水溶液萃取煙草樣品，所溶 解的糖類酸水解后在85°C的堿性介質中生成黃色的偶氮化合物，用分光光度計記錄410nm 波長的吸光度變化。該方法準確度高、重現性好，缺點在于儀器比較昂貴，且偶氮化反應時 間較長，對羥基苯甲酰肼易在管路中形成沉淀。
[0004] 熒光檢測法是最靈敏的檢測方法之一，靈敏度比紫外分光光度法高二、三個數量 級，例如海水中鈾的檢出限可達0.04μg/L;選擇性強，不同的物質具有不同的激發和發射 特性，掃描其發射或激發光譜就可較容易地將它們區分開來；此外熒光儀器結構簡單、價格 低廉且操作便捷，從實驗室檢測到工業探傷，以至前沿的生命科學，都大量采用熒光法作為 分析手段。
[0005] 然而許多關注的化學物質不含生色團，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等糖類物 質，無法直接利用熒光進行檢測，因此需要設計并合成熒光分子探針，以便將分子識別信息 通過熒光信號有效表達，從而實現直接利用熒光法檢測糖類物質。
【發明內容】
[0006] 本發明提供一種熒光分子探針、其制備方法及其在煙草水溶性總糖測定中的應 用。
[0007] 本發明的第一方面提供通式I化合物，
[0008]
[0009] 其中：1-芘丁酰胺基在吡啶環的2位或3或4位取代，-B (0H)2在苯環的間或對位 取代，X為F、Cl、Br或I。
[0010] 在一個優選的實施方案中，本發明通式I化合物具有如下結構式：
[0011]
β-
[0012] 本發明的第二方面提供一種制備通式I化合物的方法，包括以下步驟：
[0013] 1)式1所示的1-芘丁酸與式2所示的氨基吡啶在合適的條件下反應生成是II所 示的中間體；
[0015] 2)式II所示的中間體與式3所示的鹵代甲基苯硼酸在合適的條件下反應生成式 I所示的熒光分子探針，
[0016] 其中：Χ的定義通式I化合物中所述。
[0017] 本發明的第三方面提供本發明所述的通式I化合物作為熒光分子探針在檢測糖 類物質中的用途。
[0018] 本發明中，所述的糖類物質為水溶性糖類物質（包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖 等），例如煙草中的水溶性總糖。
[0019] 本發明的第四方面提供一種檢測糖類物質的方法，該方法采用本發明所述的通式 I化合物作為熒光分子探針，采用熒光法進行檢測。
[0020] 在一個優選的實施方案中，本發明所述的檢測糖類物質的方法包括以下步驟：
[0021] 1)樣品的前處理：用合適的溶劑萃取樣品中的糖類物質，然后將萃取溶液在合適 的條件下發生水解反應，然后將水解產物的pH值調節至6. 5-7,得到樣品溶液；
[0022] 2)將通式I化合物溶于甲醇中，得到探針母液，再用堿性緩沖溶液稀釋至合適的 濃度，得到探針溶液；
[0023] 3)將樣品溶液加入到探針溶液中，用熒光光譜儀測定混合溶液熒光強度。根據熒 光強度計算樣品中糖類物質的含量。
[0024] 本發明所述的檢測糖類物質的方法采用外標法定量，優選的標準物質為葡萄糖。
[0025] 本發明所述的檢測糖類物質的方法，其特征在于以下a)至d)項中的一項或多 項：
[0026]a)步驟2)中所述的探針母液的濃度為0· 004~0· 006mol/L(例如0· 005mol/L);
[0027]b)步驟2)中所述的堿性緩沖溶液的pH值為8. 0~11.0 (例如10. 0)，優選的堿 性緩沖溶液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液或碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液；
[0028]c)步驟2)中所述的探針溶液的濃度為0. 05~1.Ommol/L，優選為0. 07~ 0· 5mmol/L，更優選為 0· 08 ~0· 2mmol/L(例如 0·lmmol/L、0. 15mmol/L)；
[0029]d)步驟3)中，熒光光譜儀的激發波長為310~340nm，混合溶液的發射波長為 450~550nm，優選510nm處的相對熒光強度作為檢測信號。
[0030] 在一個優選的實施方案中，本發明所述的檢測糖類物質的方法，其中所述的糖 類物質為煙草中的水溶性總糖，其中步驟1)的樣品前處理是將樣品用酸性溶劑萃取，過 濾，讓濾液在合適的條件下發生水解反應，然后用堿性溶液中和水解產物，調節至pH值為 6. 5-7,得到樣品溶液；
[0031] 優選地，步驟1)中所述的酸性溶劑為乙酸溶液，優選為4~6v/v%乙酸溶液，例如 5v/v%的乙酸溶液；
[0032] 優選地，步驟1)中所述的水解反應是在濾液中加入等體積的鹽酸溶液（優選濃度 為0· 8~1. 2mol/L的鹽酸溶液，例如1.Omol/L的鹽酸溶液），于90~100°C(優選95°C) 水浴中加熱10~20分鐘（優選15分鐘）；
[0033] 優選地，步驟1)中所述的堿性溶液為NaOH水溶液，優選為濃度為0. 8~1. 2mol/ L的NaOH水溶液，例如1. 0mol/L的NaOH水溶液。
[0034] 在一個具體的實施方案中，本發明提供一種檢測煙草中的水溶性總糖的方法，包 括以下步驟：
[0035] 1)的樣品前處理是將樣品用酸性溶劑萃取，過濾，讓濾液在合適的條件下發生水 解反應，然后用堿性溶液中和水解產物，調節至pH值為6. 5-7,得到樣品溶液；
[0036] 優選地，步驟1)中所述的酸性溶劑為乙酸溶液，優選為4~6v/v%乙酸溶液，例如 5v/v%的乙酸溶液；
[0037] 優選地，步驟1)中所述的水解反應是在濾液中加入等體積的鹽酸溶液（優選濃度 為0· 8~1. 2mol/L的鹽酸溶液，例如1. 0mol/L的鹽酸溶液），于90~100°C(優選95°C) 水浴中加熱10~20分鐘（優選15分鐘）；
[0038] 優選地，步驟1)中所述的堿性溶液為NaOH水溶液，優選為濃度為0. 8~1. 2mol/ L的NaOH水溶液，例如1. 0mol/L的NaOH水溶液；
[0039]2)將通式I化合物溶于甲醇中，得到探針母液，再用堿性緩沖溶液稀釋至合適的 濃度，得到探針溶液；
[0040] 優選地，步驟2)中所述的探針母液的濃度為0. 004~0. 006mol/L(例如 0.005mol/L)；
[0041] 優選地，步驟2)中所述的堿性緩沖溶液的pH值為8. 0~11. 0(例如10. 0)，優選 的堿性緩沖溶液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液或碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液；
[0042] 優選地，步驟2)中所述的探針溶液的濃度為0. 05~1.Ommol/L，優選為0. 07~ 0· 5mmol/L，更優選為 0· 08 ~0· 2mmol/L(例如 0·lmmol/L、0. 15mmol/L)；
[0043] 3)將樣品溶液加入到探針溶液中，用熒光光譜儀測定混合溶液