指示癌癥療法的srm測定的制作方法
【專利說明】指示癌癥療法的SRM測定
[0001] 引言
[0002] 肺癌是最普遍的癌癥（美國每年>200, 000個新增病例）且具有五年低存活率（約 15% )。肺癌的療法從使用由放射、葉酸代謝、基于銷的藥物和/或基于紫杉醇的藥物組 成的療法的有限選擇過渡到需要組織學表征腫瘤和/或關鍵生物標志物或治療祀標蛋白 質的存在與否的更大程度祀向的治療。所有肺癌中有整整80%的肺癌屬于非小細胞肺癌 (NS化C)類型且該一般類型可基于組織學分析分成4種不同的亞型：腺癌、鱗狀細胞癌、細 支氣管肺泡癌和大細胞未分化癌。剩余20%的肺癌被稱為小細胞肺癌（S化C)。近來利用 的祀向癌癥療法已經在治療NSCLC患者和SCLC患者兩方面顯示出激動人屯、的成功。癌癥 療法的祀向方法在癌癥的生長是由一種或多種特異性祀標蛋白質驅動時最有利，其中該一 種或多種祀標癌癥的蛋白質被設計并制造成抑制該一種或多種祀標蛋白質的治療劑特異 性攻擊，因此抑制癌癥的生長。提供膚和膚序列W便在SRM/MRM測定中使用，該SRM/MRM測 定可用W定量地確定在來源于肺癌患者的腫瘤組織中直接表達或過度表達的蛋白質祀標。 運容許改進對于祀向肺癌療法的治療判斷。還提供一種SRM/MRM測定，其可用W定量地確 定在來源于具有除肺癌外的癌癥的患者的腫瘤組織中直接表達或過度表達的蛋白質祀標， 從而改進對于不是肺癌的任何其它癌癥的祀向治療判斷。
[0003] 概述
[0004] 提供來源于W下蛋白質的子序列的特異性膚：ALK、Ros、Ron、Ret、TS和FGFRl。ALK 也稱作ALK酪氨酸激酶受體和CD246且在本文中稱為ALK。Ros也稱作C-Ros受體酪胺酸 激酶且在本文中稱為Ros。Ron也稱作巨隧細胞-刺激蛋白質受體CD136和pl85-Ron且在 本文中稱為Ron。Ret也稱作原致癌基因酪氨酸-蛋白激酶受體Ret和原致癌基因C-Ret 且在本文中稱為Ret。TS也稱作胸巧酸合酶且在本文中稱為TS。FGFRl也稱作成纖維細胞 生長因子受體1和CD331且在本文中稱為FGFRl。
[0005] 來源于蛋白質的各種膚的膚序列和碎裂/過渡離子可潛在地用于基于質譜的選 擇性反應監測（SRM)測定中，其在本文中也稱為多反應監測（MRM)測定，在下文中簡稱為 SRM/MRM測定。描述了用于ALK、Ros、Ron、Ret、TS和FGFRl蛋白質和那些蛋白質的同種型 的SRM/MRM分析的膚的用途。
[0006] 可使用一種或多種、兩種或更多種、=種或更多種、四種或更多種或五種或六種 SRM/MRM測定來檢測來自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白質的特異性膚中的一種 或多種的存在并測量其相對或絕對定量水平，且由此提供通過質譜法測量在從生物樣品中 獲得的給定蛋白質制劑中那些蛋白質中的每一種的總量的方法。可自那些蛋白質得到的膚 中的全部或全部的一部分也可在單一SRM/MRM測定中同時分析或可在單個SRM/MRM測定的 任何組合中分析。所述膚各自提供通過質譜法測量在從生物樣品中獲得的給定蛋白質制劑 中相應蛋白質中的每一種的總量的潛在方法。
[0007] 本文描述的SRM/MRM測定可直接測量在由從例如福爾馬林固定的癌癥患者組織 (例如，活檢）的患者組織樣品取得的細胞制備的復雜蛋白質溶胞樣品中的運些膚。由福 爾馬林固定的組織制備蛋白質樣品的方法描述在美國專利7, 473, 532號中，其內容W引用 的方式整體并入本文中。在該專利中描述的方法可使用自ExpressionPathologyInc. (Rockville,MD)得到的LiquidTissue試劑和方案方便地進行。
[0008] 甲醒/福爾馬林固定從癌癥患者中手術移出的組織是在病理學實踐中已經接受 的慣例。因此，甲醒/福爾馬林固定的石蠟包埋組織是來自那些患者的組織的最廣泛可用 的形式。甲醒/福爾馬林固定通常采用稱為福爾馬林的甲醒水溶液。"100%"福爾馬林由 甲醒在水中的飽和溶液（約40體積％甲醒或37質量％ )組成，其具有少量用W限制氧化 和聚合程度的通常為甲醇的穩定劑。保藏組織的最常用方式是將整體組織在通常稱為10% 中性緩沖的福爾馬林的水性甲醒中持續時間（8小時-48小時）浸泡，接著在室溫下將固定 的整體組織包埋在石蠟中W便長期儲存。因此，分析福爾馬林固定的癌癥組織的分子分析 方法將是用于分析癌癥患者組織的最被接受且大量利用的方法。
[0009] 來自所述一種或多種SRM/MRM測定的結果可用于關聯在自其中收集并保藏組織 (生物樣品）的患者或受試者的具體組織樣品（例如，癌癥組織樣品）內運些蛋白質中的任 一種或全部的準確且精確的定量水平，加之運些蛋白質的潛在同種型的準確且精確的定量 水平。運不僅提供關于癌癥的診斷信息，而且容許醫師或其它醫療專業人員確定用于患者 或受試者的適當療法。提供關于在患病組織中或在另一患者/受試者樣品中蛋白質表達水 平的診斷和治療重要信息的運一測定稱為伴隨診斷測定。例如，運一測定可設計用W診斷 癌癥的階段、程度或組織學并確定將最有效阻止癌癥細胞生長的治療劑，從而確定患者或 受試者將最可能應答的治療劑。
[0010] 更具體地講，在來自患者的癌癥細胞中的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白 質中的一種或多種、兩種或更多種、=種或更多種、四種或多種、五種或多種的檢測和/或 定量指示最值得注意的是肺癌的癌癥的生長，并鑒定可通過祀向治療方案祀向的蛋白質。
[0011] 詳述
[0012] 本文所述的測定量化或測量來自包括ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白質 的蛋白質的特異性未修飾膚的相對或絕對水平并且可測量來自那些蛋白質的特異性修飾 膚的相對或絕對水平。修飾的實例包括在所述膚上存在的憐酸化氨基酸殘基和糖基化氨基 酸殘基。
[0013] 蛋白質和潛在同種型的相對定量水平可通過SRM/MRM方法學，例如通過比較SRM/ MRM波形特征峰面積（例如，波形特征峰面積或積分的片段離子強度）來確定。單個ALK、 Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl膚的相對水平可在不同樣品（例如，對照樣品和由患者或 受試者的組織制備的樣品）中確定。或者，在各種膚具有其自己的具體SRM/MRM波形特征 峰的情況下，可W比較ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl波形特征膚中的一種或多種的 多個SRM/MRM波形特征峰面積。通過比較峰面積，可W確定在一種生物樣品中或在一種或 多種額外或不同的生物樣品中相對ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白質和潛在蛋白 質同種型的含量。W此方式，可通過可在相同實驗條件下測定多個（例如，2、3、4、5或更多 個）生物樣品來確定來自那些蛋白質的一種或多種特定膚的相對量且因此確定ALK、Ros、 Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白質及其潛在同種型的相對量。另外，相對定量可通過比較通 過SRM/MRM方法學得到的一種或多種給定膚的波形特征峰面積與來自在來自生物樣品的 相同蛋白質制劑內的一種或多種不同蛋白質的一種或多種另外且不同的膚的波形特征峰 面積而對于來自在單一樣品內的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白質的所述一種或 多種給定膚來確定。
[0014] 使用所述方法學，可確定來自ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白質的特定 膚的量，因此確定相應蛋白質及其潛在同種型中的每一種的量，所述量是相對于在同一樣 品內或在不同樣品中的一者對于另一者而言的。因為單個膚或多種膚的相對定量可相對 于在樣品內或在樣品之間另外一種或多種膚的量來進行，所W可W確定所存在的膚的相對 量（例如，通過確定一種膚相對于另一種膚的峰面積），而與在生物樣品中蛋白質的絕對重 量：體積或重量：重量的量無關。因此，在來自生物樣品的蛋白質制劑中ALK、Ros、Ron、 Ret、TS和/或FGFRl膚的量可用來確定在各種樣品內及在各種樣品之間那些蛋白質的量。 通常將關于在不同樣品之間單個波形特征峰面積的相對定量數據標準化成每種樣品中所 分析蛋白質的量（例如，使用樣品的總蛋白質濃度和所分析的體積來使樣品標準化）。相 對定量可對于來自多種蛋白質的許多膚和在單一樣品中的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或 FGFRl蛋白質同時進行和/或對于許多樣品進行，W獲得對于相對蛋白質量和/或一種膚/ 蛋白質相對于其它膚/蛋白質的進一步了解。
[0015]ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白質的絕對定量水平通過例如SRM/MRM方 法學確定，由此將來自在一種生物樣品中的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl蛋白質的 單個膚的SRM/MRM波形特征峰面積與在已知量的樣品中"示蹤的"已知量的一種或多種內 標物（例如，同位素標記的標準物）的SRM/MRM波形特征峰面積相比較。在一個實施方案 中，所述內標物為合成形式的相同的精確的ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl膚，其含有 用一種或多種重同位素標記的一個或多個氨基酸殘基。合成所述同位素標記的內標物，由 此質譜分析產生與天然ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/或FGFRl膚波形特征峰不同且截然不同 并可用作比較峰的可預測且一致的SRM/MRM波形特征峰。因此，當內標物W已知量示蹤到 來自已知量的生物樣品的蛋白質或膚制劑中并通過質譜分析時，可將天然膚的SRM/MRM波 形特征峰面積與內標膚的SRM/MRM波形特征峰面積相比較。數值比較容許計算在來自生物 樣品的原始蛋白質制劑中存在的天然膚的絕對摩爾濃度和/或絕對重量，可由其確定相應 蛋白質的濃度和重量。片段膚的絕對定量數據通常根據每種樣品中所分析的蛋白質的量來 顯示。絕對定量可對于許多膚進行，其容許同時定量確定在單一樣品中的多種蛋白質（例 如，兩種、S種、四種、五種等）；和/或對于多種樣品進行，W獲得對于在單個生物樣品中和 /或在整組的單個樣品中絕對蛋白質量的了解。在一個實施方案中，蛋白質的定量可使用如 由Gygi等在美國專利7, 501，286中描述的膚標準物來進行。
[0016] 除非另作指定，否則本文使用的術語量化（quantify)、量化（quantifying)、測量 (measure)或測量（measuring)意指測定例如蛋白質、多膚、膚、標準物（例如，內標物）的 分析物的相對或絕對水平。
[0017] 本文所述的測定法可在采用例如源自患者或源自受試者的組織如福爾馬林固定 的組織時用作確定癌癥的階段的輔助手段。本文所述的SRM/MRM測定也可用作確定哪種治 療劑將最有利地用于治療該患者或受試者的輔助手段。
[0018] 為了檢驗與本文所述的肺癌相關的蛋白質的水平，可對經由手術除去部分或全部 腫瘤或經由為了確定疑似疾病的存在與否而進行的活檢方法從患者或受試者移出的癌性 組織或懷疑患癌的組織進行分析。分析所述組織的樣品W確定ALK、Ros、Ron、Ret、TS和/ 或FGFRl蛋白質中的一種或多種和那些蛋白質的形式在患者或受試者的組織中是否存在。 此外，可確定那些蛋白質中的一種或多種的表達水平并將其與在健康組織中見到的"正常" 或參考水平相比較。在健康組織中的蛋白質的正常或參考水平可來源于例如沒有癌癥的一 個或多個個體的有關組織。或者，可通過分析未受癌癥影響的有關組織（例如，相同器官的 部分）對于具有癌癥的個體獲得正常