包含包封的antagomir的組合物的制作方法

包含包封的antagomir的組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及旨在預防或治療屯、臟疾病，包括屯、臟缺血性疾病的藥物制劑的領域。
【背景技術】
[0002] 急性屯、肌梗死（AMI)，也稱為屯、肌梗死并通常被稱為屯、臟病發作，代表世界上大多 數工業化國家的一個主要健康風險，并且仍然是世界范圍內發病率和死亡率的主要原因。
[0003] 通常，AMI是由突然且持續缺乏流向屯、臟組織的血液造成，運一般是冠狀動脈狹窄 或閉塞的結果。沒有充分的血液供給，所述組織變得缺血，造成屯、肌細胞（屯、臟肌肉細胞） 和血管結構的死亡。
[0004] 近幾十年來在治療AMI中有很多進展，主要設及與藥物療法相結合的冠狀動脈再 灌注。再灌注療法已經通過減少梗死面積和改善短期和長期的發病率和死亡率而成功改變 AMI的自然進展。然而，使用目前可獲得的兩種再灌注策略有實質性的限制：纖維蛋白溶解 導致低程度的冠狀動脈通透性，在AMI進化的開始幾小時期間不能頻繁應用初期血管成形 術。此外，在一些插管的患者中，除了正常的屯、外膜血流，出現"無復流"現象或缺乏微血管 再灌注，導致不良功能性結果。運意味著再灌注療法不能預防屯、肌的有害重構（膠原蛋白 瘤痕形成的復雜的內在修復過程，導致屯、室擴張、收縮功能障礙和隨后的屯、臟衰竭）的發 生。它在大約30%AMI中的發生主要與仍知之甚少的較大的梗死面積、微血管阻塞及不良 修復反應有關。
[0005] 因為修復性纖維化和缺血組織的功能恢復依賴于建立供應氧合血的網絡，已經做 出努力W通過在愈合區域誘導新血管形成來改善血管床，從而在原位實現將損傷區域直接 轉變為功能性組織。
[0006] 血管生成的治療性誘導可W減輕運種現象的發生。盡管如此，若干年靜脈促血管 生成因子的臨床試驗結果并不令人滿意。不被理論束縛，認為造成運種失敗的原因之一是 靜脈途徑不能夠在嚴重受損的屯、臟條件下到達并在祀組織中維持有效的藥物濃度，從而促 進并維持功能性的血管網絡。
[0007] 為了解決運個問題并預防AMI后的屯、功能不全，在過去十年內開始了再生屯、肌和 血管可能性的研究。施用多能祖細胞和灌注血管生長因子的初始研究顯示有前途的結果， 但轉到臨床設置則顯示運些治療不能W足夠恢復被破壞的屯、肌的方式再生新血管。
[0008] 今天，血管生成和用細胞治療的受損屯、臟的再增殖W及特定的藥物和再同步化治 療能夠減緩運種現象的進展，但預防它的發生對于屯、臟醫學仍然是有疑問的挑戰。因此，需 要預防有害的左屯、室重構的新的治療策略。
[0009] 發巧簡沐
[0010] 本發明設及通過施用通過調節microRNA的活性或表達來逆轉或預防屯、室重構 的組合物治療屯、臟疾病，優選缺血性疾病。更具體地，本發明提供包含設及血管生成的 microRNA的抑制劑的組合物，所述抑制劑優選包含于能夠將所述抑制劑局部釋放至缺血祀 組織的新的遞送介質中。此外，本發明提供逆轉或預防屯、室重構的方法和用于所述方法的 試劑盒。
[0011] 本發明設及一種組合物，其包含有效量的至少一種設及血管生成的miRNA或其前 體的抑制劑，其中將所述抑制劑微包封成聚合的生物可降解且生物相容的微球。
[0012]在上述組合物的一些實施方案中，所述miRNA選自包含miR-92 (包括miR-92a-l、 miR-92a-2 和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-l和miR-16-2)、 miR-374 (包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24 (包括miR-24-l和miR-24-2)、 miR-483、miR-：M(包括miR-：Ma、miR-34b和miR-：Mc)、miR-20 (包括miR-20a和miR-20b)、 miR-15 (包括miR-15a和miR-15b)的家族。
[0013] 在上述組合物的一些實施方案中，所述miRNA的抑制劑是長度為8-49個核巧酸的 具有祀向所述miRNA或其前體的序列的寡核巧酸。在某些實施方案中，所述寡核巧酸是與 所述祀miRNA或其前體至少部分互補的反義寡核巧酸。所述反義寡核巧酸選自核糖核巧 酸、脫氧核糖核巧酸、小RNA、antagomir、LNA、CDNA、PNA、嗎嘟代寡核巧酸或它們的組合。
[0014] 在上述組合物的一些實施方案中，所述miRNA的抑制劑由antagomir組成，優選由 包含核巧酸序列的antagomir組成，所述核巧酸序列包含至少16個與選自本文所述的SEQ ID NO :1-58的序列的核巧酸互補的連續核巧酸。
[001引在上述組合物的一些實施方案中，所述miRNA的抑制劑由包含序列SEQIDNO:59 或60和其除堿基替換之外的修飾，及其片段的antagomir組成，所述片段由SEQIDNO:59 或60的至少8個連續核巧酸的子序列組成。
[0016] 在上述組合物的一些實施方案中，所述微球的直徑不超過25ym，包括直徑為 5-20ym，優選5-15ym的微球。
[0017] 在上述組合物的一些實施方案中，所述微球由聚-d，l-丙交醋（PLA)組成的聚合 物制成，所述聚合物任選地與一種或多種其他聚合物混合。
[0018] 本發明還設及逆轉或預防需要其的受試者屯、室重構的方法，包括向所述受試者施 用有效量的上述組合物。
[0019] 本發明還設及生物可降解且生物相容的微球群體用于治療或預防屯、肌梗死的用 途，其中所述微球：
[0020] -平均直徑為 5-20Jim，優選 5-15Jim;
[0021]-由聚-d，^丙交醋-乙交醋共聚物（PLGA);聚-d，1-丙交醋（PLA)或它們的混 合物制成；
[002引-包含1% -15%w/w的能夠預防屯、室重構的治療劑；
[0023] 其中所述治療劑由選自W下的miRNA或其前體的抑制劑組成：miR-92 (包 括miR-92a-l、miR-92a-2 和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-l和 miR-16-2)、miR-374 (包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24 (包括miR-24-1 和 miR-24-2)、miR-483、miR-：M(包括miR-：Ma、miR-34b和miR-：Mc)、miR-20 (包括miR-20a 和miR-20b)、miR-15 (包括miR-15a和miR-15b)，優選miR-92a。
【附圖說明】
[0024]圖I顯示通過掃描電鏡測定的antagomi;r-92a-PLGA微球的形態。
[00巧]圖2顯示通過激光散射測定的antagomi;r-92a-PLGA微球的尺寸分布。
[0026] 圖3顯示通過重復注射微球直到120mg對血液動力學和左屯、室收縮性的作用。
[0027] 圖4顯示通過重復注射微球直到240mg對血液動力學和左屯、室收縮性的作用。
[0028] 圖5顯示單次冠狀動脈內注射根據本發明的微球的分子作用的研究方案。
[0029] 圖6顯示本發明的微球對miR-92a的抑制特異性。
[0030] 圖7顯示包封的antagomi;r-92a誘導梗死組織中的血管生成。通過將血管總數除 W總的梗死面積計算梗死區的血管密度。N= 20.沖<0. 01。
[003。圖8 :間接測量。AMI后一個月，在用包封的antagomir-92a、安慰劑或鹽水處理的小豬的梗死相關動脈中測量基礎和最小的微血管阻力指數。（a)用血壓（mmHg)乘W冠脈流 量（ml/min)來計算基礎微血管阻力指數（MRI)，所述血壓用位于頂端LAD(Pd)的壓力線測 量，和所述冠脈流量用位于LAD遠段的感應器定量。用在最大充血測量的相同參數計算最 小微血管阻力指數（MRIhyp)，所述最大充血通過向股靜脈12F銷靜脈輸注140mg/min的腺巧 來實現。n=12*p<0. 01**p=0. 05。化）壞死區中血管總數和MRI之間的關系。R2 0. 41，p =0. 02,n=12。（C)壞死區中血管總數和最小MRI之間的關系。R2 0. 27,P=0. 08,n= 12。
[0032] 圖9:直接測量。AMI后一個月，在用包封的antagomir-92a處理和不處理的小豬 的梗死相關動脈中測量基線和實際微循環阻力。（a)用血壓（mmHg)除W冠脈流量（ml/min) 來計算基線微循環阻力（基線MR)，所述血壓用位于頂端LAD(Pd)的壓力線測量，和所述冠 脈血流量用位于LAD遠段的感應器定量。處理組的基線MR顯著低于對照（7. 47 + 1. 33VS 19. 62 + 2. 98,P= 0.005)。n= 13。用在最大充血測量的相同參數計算實際微循環阻力 (TMROiyp))，所述最大充血通過向股靜脈12F銷靜脈輸注140mg/min的腺巧來實現。在處 理組中觀察到顯著低于對照的TMR化yp) (5. 0 + 1. 15vs14. 49 + 2. 4,P= 0. 006)。n= 13。 化）所有壞死區中血管密度與基線MR之間的關系。R2= 0. 35,P= 0. 033,n= 13。（C)所 有壞死區中血管密度與TMRQiyp)之間的關系。R2= 0. 31，P= 0. 047,n= 13。
[0033] 圖10 :AMI后一個月，用對分配處理盲法的超聲屯、動圖評估隔頂運動障礙 (S巧toapical diskynesia)的存在。顯示了處理和未處理動物中患有隔頂運動障礙動物的 百分比（83. 3%VS16. 7%，P= 0. 0：3)。n= 20。
[0034] 圖11:體外評估包封的antagomir92a和未包封的antagomir92a對miR92a表 達的作用。
[0035] 圖12:包封的antagomir17和20a對它們各自miRNA的作用。
[0036] 發巧詳沐
[0037]W下給出由本發明涵蓋的所有實施方案的描述相關的一些定義。
[003引MicroRNA(MiR)是作為生物過程關鍵調節器的小的非編碼RNA。
[0039] "MicroRNA"、"miRNA"或"miR"是指長度為約18至約25個核巧酸的非編碼RNA。 運些miR可W來自多種來源，包括：編碼miRNA的單個基因，來自蛋白編碼基因的內含子，或 來自通常編碼多個密切相關的microRNA的多順反子的轉錄物。
[0040] 目前的知識顯示，miRNA由RNA聚合酶II(polII)或RNA聚合酶III(polIII) 轉錄，且來自一般為幾千個堿基長的稱為初級miRNA轉錄物（pri-miRNA)的初始轉錄 物。pri-miRNA在細胞核中被RNase化OSha加工成約70-100個核巧酸的發夾型前 體（pre-miRNA)。被運輸到細胞質后，發夾pre-miRNA進一步被Dicer加工W產生雙鏈 microRNA;然后被稱為成熟microRNA的其中一條鏈（有時兩條鏈均可使用）被整合到RNA誘導的沉默復合物巧ISC)，其中它與它的祀mRNA通過堿基對互補相關聯。在相對罕見情 況下，即當HiiRNA堿基對與信使RNA(mRNA)祀標完全配對時，它促使mRNA降解。更普遍的， microRNA與祀mRNA形成不完美的異源雙鏈體，影響mRNA的穩定性或抑制mRNA的翻譯。
[00川"莖環序列"是指具有發夾結構且包含成熟miRNA序列的RNA。pre-miRNA序列和 莖環序列可W重疊。莖環序列的實例可W在名為miRBase的microRNA數據庫中發現。
[0042] "microRNA前體"是指來源于基因組DNA且包含含有一個或多個microRNA序列的 非編碼結構化RNA的轉錄物。例如，在某些實施方案中，microRNA前體是pre-miRNA。在某 些實施方案中，microRNA前體是pri-miRNA。
[0043]W下說明書將遵循標準命名系統，其中沒有大寫的"mir-X"是指pre-miRNA，而大 寫的"miR-X"是指成熟形式。當兩個成熟microRNA來自相同pre-miRNA的不同臂，它們分 別被加W后綴-化或-5p。當相對表達水平已知時，名稱后面的星號表示microRNA相對于 發夾另一條臂的microRNAW低水平表達。
[0044] 在W下說明書中，除非另有說明，表述miR-X(如果有的話）用來指包括-化和-5p 兩種形式的成熟miRNA。
[0045] 為了避免疑問，在本說明書中，表述mic;roRNA、miRNA和MiR是指相同產物。
[0046] 因此，在本發明上下文中，目的是用特別關注的設及血管生成的microRNA調控血 管生成或血管生成過程。因此，本發明的目的是調控屬于設及血管生成調控的microRNA家 族的至少一種microRNA。
[0047] 表述"microRNA家族"意欲是指具有由調控血管生成或血管生成過程組成的相關 功能的一組microRNA。更具體地且非限制性地，所述microRNA選自顯示出抗血管生成活性 的microRNA。
[0048] 更具體地，且非限制性地，運種microRNA選自miR-92 (包括miR-92a-l、miR-92a-2 和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-l和miR-16-2)、miR-374(包 括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1 和miR-24-2)、miR-483、 miR-：M(包括miR-：Ma、miR-34b和miR-：Mc)、miR-20 (包括miR-20a和miR-20b)、miR-15 (包 括miR-15a和miR-15b)，或其前體。對血管生成具有調控性質，優選括抗性的任何miRNA應 當被認為是該microRNA家族的一部分，運對于本領域技術人員而言是顯而易見的。
[004引為了避免疑問，除非另有說明，W下說明書中的表述microRNA將是指已經從它的 前體切割的成熟或經加工的RNA。對于非成熟形式，將使用表述"前體"或"microRNA前體"。
[0050] 下表1將本說明書涵蓋的microRNA前體的不同序列進行了重新分組。
[0051]
[0053] 表I
[0054] 對于各個microRNA，下表2顯示microRNA的序列和進入相應前體序列的相應殘基 (參見表1)。
[00 巧]

[0057]表 2
[005引除非另有說明，本申請中所指的前體和microRNA序列是人序列。然而，在某些情 況下，microRNA人序列與來自其他物種的microRNA序列同源。
[0059] 作為一個實例可W提及，人miR-92a與來自其他物種的miR同源。更具體地， 人miR-92a與來自血e(D;rosophilamelanogaster，黑腹果蛹）、mmu(Musmus州lus，小家 鼠）、rno(Rattusnorvegicus，褐家鼠）、dps值rosophilapseudoobscura，擬暗果蟲單）、 aga(Anophelesgambiae，岡t：t亞按蚊）、dre值aniorerio,斑馬魚）、mml(Macacamulatta， 雜猴）、xtr(Xenopustropicalis，熱帶爪贍）、ame(Apismellifera，意大利蜜蜂）、 odi((Mkopleuradioica，異體住囊蟲）、cin(Cionaintestinalis，玻璃海銷）、csa(Ciona savign}d，薩氏海銷）、cfa(Canisfamiliaris，家犬）和豬或ssc(Susscrofa，野豬）的 miR同源。
[0060] 根據其公知常識，本領域技術人員將容易發現其他人microRNA序列和來自其他 物種的microRNA序列之間的同源性。
[0061] 本文所述的成熟microRNA的核酸序列W及它們相應的莖環序列是在在線可檢索 的microRNA序列和注釋的數據庫miRBase中發現的序列。miRBase序列數據庫的進入代表 預測的microRNA轉錄物的發夾部分（莖環），W及成熟microRNA序列的定位和序列信息。 數據庫中的microRNA莖環序列不是嚴格的前體miRNA (pre-miRNA)，而在某些情況下可W 包括pre-imRNA和來自假定初級轉錄物的側翼序列。
[0062] 因此，本發明的目的是提供用于治療或預防AMI后屯、室重構的組合物，所述組 合物包含設及控制血管生成