生長激素化合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明的領域是主要通過重組方法制備的生長激素化合物。作為野生型生長激 素，運樣的化合物可用來治療其中具有生長激素活性的化合物的血漿濃度增加對患者有益 的疾病或病癥。
[000引背景 生長激素（GH)是由哺乳動物垂體前葉分泌的多膚激素。取決于物種，GH是一種包含 大約190個氨基酸殘基（相當于大約22kDa的分子量）的蛋白。GH結合于細胞表面受 體（GH受體（GHR))，并通過細胞表面受體發出信號。GH在促進生長，維持正常的身體成 分，合成代謝和脂質代謝中起重要作用。它還具有對中間代謝的直接作用，例如降低葡萄 糖攝取，增加脂肪分解，增加氨基酸攝取和蛋白合成。激素也對其它組織包括脂肪組織、 肝、腸、腎、骨骼、結締組織和肌肉發揮作用。重組hGH(生長激素）是可市售獲得的，例 如作為：Geno1:;ropin? (Pfizer)、Nirtropin?和Protropin? (Genentech)、Humatrope? (EliLilly)、Serostim? (Serono)、Norditropin(NovoNordisk)、0mnitrope(Sandoz)、 NutropinD巧ot(GenentechandA化ermes)。另外地，在N-末端具有另外的甲硫氨酸殘 基的類似物也作為例如：Somatonorm?(PharmaciaUpjohn/Pfizer)上市。
[0003]GH與細-蛋白家族的其它成員，催乳素（P化）和胎盤生乳素（PU,共享一種共 同的拓撲結構。GH被分類為一種四螺旋的束蛋白，其呈現一種具有兩個保守的二硫鍵的 "上-上-下-下"拓撲結構。特別地，成熟野生型人GH(由SEQIDNO: 1鑒別的hGH)包 含191個氨基酸殘基并在53、165、182和189位置含有4個半脫氨酸殘基，其通過形成分別 連接C53與C165和C182與C189的兩個分子內二硫鍵，穩定蛋白的S維結構。hGH的結構 已通過X射線結晶學在游離形式（QiantaletL等（1995)ProteinandPeptideLetters 3，333-340)和在與其結合蛋白（人GHR化GHR)的細胞外結構域）的復合物中（deVos,A. M.等（1992)Science255，306-312)經實驗確定。運些結構已存入蛋白質數據庫（PDB) 且為公眾可獲得的（PDB檢索碼分別為IHGU和1HWG)。因此，可W從公布的hGH結構，鑒定 對結合于hG皿的hGH為重要的殘基。研究證實，各種突變體具有對生長激素受體的較低的 親和力（化nnin曲amBC,Proc化tlAcadSciUSA. 1991Apr15;88(8): 3407-11 和 Cunnin曲amBC,WellsJA,Science. 1989 化n2;244(4908): 1081-5)。此外，h細的動 態特性已通過核磁共振（NMOLR)光譜研究化asimovaM.R.等J.Mol.Biol. (2002) 318， 679-695)。成熟人GHR在此由SEQIDNO: 2 (包含由信號膚去除生成的GHR基因編碼蛋 白的AA19-638)鑒定。也稱為生長激素結合蛋白的細胞外部分構成AA19 - 256。
[0004]hGH已經受廣泛的誘變并被修飾W試圖產生具有改變的化學或生物學特性的hGH 類似物及其綴合物，包括生長激素的半脫氨酸突變體、蛋白酶穩定的突變體和聚乙二醇化 形式，如在例如US2003/0162949、W0 02/055532 和W02006048777 中描述的。
[0005] 在具有增加功能性的生長激素化合物的探索中，需要具有增加的半壽期的化合 物，W減少所需化合物的量和給予治療劑的頻率。
[0006] 受抗體治療的巨大成功的啟發，使用抗體免疫球蛋白Fc區域作為延長 子（protractor)的深入研究提供了具有增加半壽期的生長激素化合物，如描述于W02012/008779 和W02006/107124、W02005 047334/35/36/37 中的化合物，其中Fc區 域經由非膚基聚合物（PEG)共價連接于生長激素，和生長激素融合物，例如如描述于WO 01/03737、W0 200814743、US7404956、W0 04101739 和W02005001025 中的Fc融合物。 US2012/0116056描述人生長激素化GH)的Fc融合蛋白和旨在減少不需要的Fc-介導的副 作用的特定人IgGFc變體的選擇。
[0007] 雖然運樣的方法適合于增加hGH的半壽期，但增加生長激素化合物的半壽期和穩 定性的愿望甚至更加保持高優先級，W便能夠提供給患者便利的治療劑。
概述 本發明的主要方面設及具有延長的半壽期的生長激素化合物，如本文通過與免疫球蛋 白Fc區域的融合物所舉例的。所述化合物的特征與人生長激素比較還在于改變的氨基酸 序列，改變一個或多個氨基酸殘基。運樣突變的不尋常的特征旨在部分地改變與人生長激 素比較的功能。
[0011] 運樣的生長激素變體在延長的生長激素化合物的情況下提供甚至進一步延長的 半壽期，同時保留人生長激素的生物學活性。因此，運樣的化合物可有助于解決提供治療的 生長激素化合物的問題，所述化合物可W低頻率和W低劑量給予，W提供給患者能夠增加 在血液中的生長激素活性的便利的產品。在一個實施方案中，本發明設及包含連接于抗體 Fc-結構域的生長激素變體（GH-變體-Fe)的生長激素化合物。在一個運樣的實施方案中， 所述化合物由兩個多膚組成，一個是GH-變體-Fe多膚融合物和一個是與GH-變體-Fe多 膚融合物的Fe序列連接的Fe-多膚。在一個實施方案中，生長激素化合物包含在GH變體 的序列中的1-5個點突變，其減少對生長激素受體的親和力。依據本發明的生長激素化合 物顯示出體內延長的半壽期燈1/2)W及誘導延長的IGF-反應的能力。
[0012] 本發明的其它方面設及生產運樣的化合物，特別是編碼GH-變體-Fe融合多膚的 DNA序列和載體和包含運樣的編碼GH-變體-Fe融合多膚的載體任選與編碼Fe多膚的載體 組合的宿主細胞的方法和工具。
[0013] 附圖簡述 圖1顯示4個生長激素變體Fe-融合化合物的藥代動力學曲線圖。每個生長激素Fe-融 合化合物具有相同的一般結構：hGH-接頭-Fe(IgGl)/Fe(IgGl)。生長激素序列中的突變在 每個分子的圖例中指明。
[0014] 圖2顯示，在單劑量靜脈內給予Sprague Dawley大鼠后，生長激素變體Fe-融合 化合物的IGF-I血漿濃度-時間曲線圖。圖2A顯示IGF-I的總濃度，而圖2B顯示基線校 正的IGF-I血漿濃度。生長激素序列的突變在每個分子的圖例中指明。
[0015] 圖3顯示，在單劑量靜脈內給予15nmolol后，生長激素變體Fe-融合化合物對垂 體切除的SpragueDawley大鼠體重的影響。生長激素序列的突變在每個分子的圖例中指 明。
[001引定義 術語"結合親和力"在此用作兩個分子（例如受體和配體）之間的非共價相互作用的 強度的量度。術語"結合親和力"被用來描述單價相互作用（固有活性）。
[0017] 術語"核巧酸序列"被用來限定編碼多膚的DNA(或RNA序列）。
[0018] 術語"氨基酸"包括由遺傳密碼編碼的氨基酸組，其在此稱為標準氨基酸。還包括 的是不由遺傳密碼編碼的天然氨基酸，W及合成氨基酸。
[0019] 本文所用的術語"多膚"和"膚"意指由至少兩個通過膚鍵連接的氨基酸組成的化 合物。
[0020] 本文所用的術語"蛋白"意指由一個或多個多膚組成的指生物化學化合物。
[0021] 術語"藥物"、"治療劑"、"藥劑"或"藥品"當在此使用時，指用于藥用組合物的活 性成分，其可用于療法中。
[0022] 術語"生長激素變體"在此用來描述生長激素蛋白的類似物，其具有不同于由SEQ IDNO1鑒定的成熟人生長激素的序列的氨基酸序列。
[0023] 術語"Fe-結構域"在此用來描述兩個Fe多膚的復合物。
[0024] 術語"復合物"在此用來描述至少兩個多膚的結合，運兩個多膚并不通過在編碼核 巧酸序列的翻譯期間建立的膚鍵連接。所述結合可W是共價的或非共價的。
[0025] 術語"延長的部分"在此用于定義具有延長蛋白的體內半壽期的能力的單位。術語 因此包含熟知的實體，例如Fc-結構域、PEG分子、血清白蛋白、白蛋白粘合劑、生長激素結 合蛋白、AA聚合物（如用于XTEN技術（Amunix,MountainView,CA),和用于PASylation? 狂L-蛋白GMBH,化eising,德國）），和碳水化合物組例如徑乙基淀粉和細菌肝素前體 化ep曰ros曰n)。
[0026] 描述 本發明設及包含連接于抗體Fc-結構域的生長激素變體的生長激素化合物，運樣的化 合物可W簡稱為"GH-變體-Fc"。
[0027] 生長激素化合物 成熟人生長激素蛋白包含用3個環（環1-3或L1-3)連接的4個螺旋（螺旋1-4或 化-4)，和C-末端區段。在人生長激素中，螺旋1由AA殘基6-35限定，螺旋2由AA殘基 71-98限定，螺旋3由AA殘基107-127限定和螺旋4定義為AA殘基155-184。通過生長激 素受體的相互作用，生長激素介導其生物學活性。
[0028] 如將在本文下面所描述的，依據本發明的生長激素化合物包含生長激素部分和延 長的部分，生長激素部分被認為負責化合物的生物學功能性，而延長的部分至少部分地負 責延長生長激素化合物的半壽期。
[0029] 因此，生長激素化合物通常包括生長激素多膚，例如具有與如通過SEQIDNO1鑒 定的人生長激素的高水平同一性的氨基酸鏈。如在本文下面所描述的，依據本發明的生長 激素化合物包含如由不同于人生長激素的序列的蛋白序列所限定的生長激素變體。
[0030] 依據本發明的生長激素化合物涵蓋生長激素融合物和生長激素綴合物二者。如 從措辭上顯而易見的，生長激素融合化合物包括借助于至少一個膚鍵連接于第二蛋白序列 的生長激素序列，而生長激素綴合物指生長激素部分和延長的部分通過化學修飾的共價連 接。融合蛋白的生成是本領域熟知的且通常經使用重組表達載體表達融合蛋白而獲得，所 述載體將編碼所述生長激素序列的DNA序列與編碼所述第二蛋白的第二DNA序列（任選地 包括接頭序列）連接。生長激素融合物包括，但不限于，包含抗體Fc-結構域的融合物。
[0031] 同樣地，生長激素部分和延長的部分的綴合可通過本領域已知的方法獲得，其中 Fc-結構域共價連接于生長激素變體。連接可W是在N-末端或C-末端氨基酸殘基或在生 長激素變體的鏈中氨基酸殘基上。點突變可被引入生長激素W促進延長部分的運樣的連 接。
[0032] 在一個實施方案中，本發明設及包含連接于抗體Fc-結構域的生長激素變體的生 長激素化合物，其可通過GH-變體-Fc描述。
[0033] 生長激素變體 依據本發明的生長激素變體具有不同于由SEQIDNO. : 1鑒定的成熟人生長激素序列 的序列。
[0034] 所述差異可通過與天然存在的人生長激素序列比較，添加和/或缺失和/或替代 至少一個氨基酸殘基而引起。該術語是用于突變生長激素蛋白的，其中生長激素序列的一 個或多個氨基酸殘基已被另一個氨基酸殘基替代和/或其中一個或多個氨基酸殘基已從 生長激素缺失和/或其中一個或多個氨基酸殘基已經添加和/或插入生長激素中。
[0035] 在一個實施方案中，依據本發明的生長激素變體包含相對于人生長激素的少于8 個修飾（替代、缺失和/或添加）。在一個實施方案中，生長激素變體包含相對于人生長激 素的少于7個修飾（替代、缺失和/或添加）。在一個實施方案中，生長激素變體包含相對 于人生長激素的少于6個修飾（替代、缺失和/或添加）。在一個實施方案中，生長激素變 體包含相對于人生長激素的少于5個修飾（替代、缺失和/或添加）。在一個實施方案中， 生長激素變體包含相對于人生長激素的少于4個修飾（替代、缺失和/或添加）。在一個實 施方案中，生長激素變體包含相對于人生長激素的少于3個修飾（替代、缺失和/或添加）。 在一個實施方案中，生長激素變體包含相對于人生長激素的少于2個修飾（替代、缺失和/ 或添加）。在一系列的實施方案中，生長激素的生長激素變體與由SEQIDNO: 1鑒定的人 生長激素有至少95、96、97、98或99 %同源性。
[0036] 在一個實施方案中，生長激素變體包含正好7個氨基酸修飾。在一個實施方案中， 生長激素變體包含正好6個氨基酸修飾。在一個實施方案中，生長激素變體包含正好5個 氨基酸修飾。在一個實施方案中，生長激素變體包含正好4個氨基酸修飾。在一個實施方 案中，生長激素變體包含正好3個氨基酸修飾。在一個實施方案中，生長激素變體包含正好 2個氨基酸修飾。在一個實施方案中，生長激素變體包含正好1個氨基酸修飾。
[0037] 如上所述，生長激素的總體結構是眾所周知的和二維和=維結構識別可至少被部 分地分配不同的功能的各個區域。二級結構限定螺旋1-4和插入的環1-3。生長激素受體 結合已被分配至稱為位點1和位點2的=維位點，其各自跨多個不連續的氨基酸序列段。如 本文描述的，與包含由SEQIDNO1鑒定的人生長激素的hGH或GH化合物比較，由于在位 點1或位點2的點突變或AA缺失，GH化合物/GH變體優選地具有經由位點1或位點2與 hGHR較低的結合親和力。
[0038] 在一個實施方案中，生長激素變體在位點1 (螺旋1巧-35)和環1 (36-71)和螺 旋4 (155-184))具有至少一個點突變，例如在螺旋1，在對應于Metl4、Hisl8、His21、Gln22 和化e25的位置。
[0039] 在一個實施方案中，生長激素變體在環1，例如在對應于Lys41、Tyr42、Leu45、 Gln46、Asn47、P;ro48、Gln49、Ser51、Leu52、ProSg、ProGI、Ser62、Asn63、Ar挑 4、Glu65、！'虹 67 和Gln68的位置或例如在對應于Lys41、Leu45、Pro59、Pro61、Arg64和Glu65的位置具有 至少一個點突變。
[0040] 在一個實施方案中，生長激素變體在螺旋4,例如在對應于Tyr164、Argl67、 Lysl68、Aspl71、Lysl72、Glul74、T虹 175、Phel76、A巧 178、Ilel79、Cysl82、切sl89 和 Glyl90的位置或例如在對應于Lysl72、Glul74、T虹175、化6176和Argl78的位置具有至 少一個點突變。
[0041] 在一個實施方案中，生長激素變體在位點2 (N-末端和螺旋1 (1-35)和/或環2/ 螺旋3 (99-127))具有至少一個點突變。
[0042] 在一個實施方案中，生長激素變體在N-末端和螺旋1，例如在對應于化el、Pro2、 1164、？'〇5、1^6116、4'妍、1^6119、431112、41日13、1^61115、4'邑16和4'邑19的位置具有至少一個點 突變。
[0043] 在一個實施方案中，生長激素變體在環2/螺旋3例如在對應于Vall02、Tyrl03、 Asnl09、Aspll6、Leull7、Glull9、Glyl20 和！'虹 123 的位置具有至少一個點突變。
[0044] 在一個實施方案中，生長激素變體在螺旋3 (AA107-127)，例如在對應于Asnl09、 Asplie、Leull7、Glull9、Glyl20和！'虹123的位置具有至少一個點突變。
[0045] 在一個實施方案中，生長激素變體在對應于G120的位置具有點突變。
[0046] 在一個實施方案中，生長激素變體在對應于Lys41、Ar挑4、Lysl72和/或Glyl20 的位置具有至少一個點突變。
[0047] 在一個實施方案中，生長激素變體在對應于Lys41、Ar挑4、Lysl72和/或Glyl20 的位置具有至少兩個點突變。
[0048] 在一個實施方案中，生長激素變體在對應于Lys41、Ar挑4、Lysl72和/或Glyl20 的位置具有至少3個點突變。
[0049] 在一個實施方案中，生長激素變體在對應于Lys41、Arg64和/或LyS172的位置具 有至少一個點突變。
[0050] 在一個實施方案中，生長激素變體在對應于Lys41、Arg64和/或LyS172的位置具 有至少兩個點突變。
[0051] 在一個實施方案中，生長激素變體具有正好1、2或3個點突變。在一個實施方案 中，生長激素變體在對應于Lys41、Arg64或LyS172的位置具有單一的突變。
[0052] 在一個實施方案中，生長激素變體具有選自K41A、R64A和K172A的1個點突變。 在一個實施方案中，生長激素變體具有選自K41A、R64A和K17