猴逆轉錄病毒的rt-lamp檢測引物組、試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學技術領域，設及實驗動物相關病原的檢測方法，具體設 及一種猴逆轉錄病毒（SRV)的RT-LAMP(ReverseI'ranscriptionandLoop-mediated IsothermalAmplification,反轉錄環介導等溫擴增反應）檢測引物組、檢測試劑盒及檢測 方法。
【背景技術】
[0002] 猴逆轉錄病毒（SimiantypeDretrovirus,SRV)，屬于逆轉錄病毒科、腫瘤病毒 亞科的D型病毒。SRV具有逆轉錄病毒所共有的特性，是單鏈RNA病毒，內含逆轉錄酶，病毒 顆粒呈球形，直徑80-lOOnm，囊膜上缺乏明顯的纖突，感染細胞漿內的病毒為A型顆粒，細 胞外未成熟病毒的核屯、為圓形，成熟病毒的核屯、為圓柱狀。病毒W出芽的方式從細胞膜上 釋放。SRV可在多種猴的細胞包括猴的B細胞、T細胞、成纖維細胞、唾液腺上皮細胞、膜腺 細胞等中生長。SRV為猴艾滋病的主要病原體之一，.感染后臨床上表現為頑固性腹瀉、體 重減輕、全身性淋己腺病脾腫大、貧血、中性白細胞減少、淋己細胞減少、壞死性口炎、腹膜 后纖維瘤病等。
[0003] 到目前為止，發現感染SRV病毒并產生猴艾滋病的非人靈長類動物主要是雜猴屬 的動物。近年來，已有SRV感染人的報道。SRV必須通過直接接觸才能在猴間進行傳播， 主要通過猴間相互撕咬使含于唾液中的病毒進入傷口而傳播，而在所有的分泌物和排泄物 中，唾液含病毒量最高。SRV也能通過性傳播和經胎盤傳播。SRV對不同年齡的猴致病性有 差異，3歲W上的猴抵抗力較未成年猴強，6個月至2歲半的猴最易感，6個月W下的猴有母 源抗體的保護。雄猴和雌猴均易感染，但雌猴的病例較多。
[0004] SRV已經被確認為是導致SAIDS的病原體，因此，在猴艾滋病動物模型建立之前一 定要排除運種病原體的干擾。SRV感染的診斷除了檢查臨床癥狀，還要結合實驗室診斷方 法，常用的實驗室診斷方法有PCR法、酶聯免疫吸附試驗（ELISA)法、間接免疫巧光（IFA) 法、免疫印跡(WB)法、病毒分離法等。PCR法快速、靈敏，但其擴增產物需要進行再一次驗 證。病毒分離需要進行細胞培養，周期長、對試驗設備要求高，因此，該方法不適合一般的檢 。目前，對SRV的檢測常用ELISA法和IFA法作為初篩，還必須用WB檢測特異性抗體才 能最終確診。ELISA法和IFA法檢測的假陽性率高及WB法操作程序復雜，在一定程度上限 制了其應用范圍。因此，不論是為了保障整個猴群的健康還是飼養人員、科研人員的人身安 全，都有必要建立一種方便、快捷、靈敏、特異性強的檢測方法。
【發明內容】
[0005] 本發明的一個目的在于提供一種猴逆轉錄病毒的RT-LAMP檢測引物組。
[0006] 本發明的另一個目的在于提供一種猴逆轉錄病毒的RT-LAMP檢測試劑盒。
[0007] 本發明的另一個目的在于提供猴逆轉錄病毒的RT-LAMP檢測方法。
[000引本發明所采取的技術方案是： 一種用于快速檢測猴逆轉錄病毒的RT-LAMP檢測引物組，其包括一對外引物和一對內 引物，其核巧酸序列分別如下所示： 外引物：
[0009] 一種用于快速檢測猴逆轉錄病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其包括上述檢測引物 組。
[0010] 進一步的，所述猴逆轉錄病毒的RT-LAMP檢測試劑盒中，外引物、內引物的摩爾比 為 1 :8。
[0011] 進一步的，所述猴逆轉錄病毒的RT-LAMP檢測試劑盒中還含有DNA聚合酶、逆轉錄 酶、RT-LAMP反應液、陽性對照和陰性對照、顯色液。
[0012] 進一步的，所述DNA聚合酶為BstDNA聚合酶，所述逆轉錄酶為AMV逆轉錄酶。
[001引進一步的，所述RT-LAMP反應液含有IOmM dNTP、IOX化ermo化1反應緩沖液、 150mM M拆04水溶液。
[0014] 進一步的，所述陽性對照為含有目的基因片段的質粒DNA，陰性對照為DEPC水。
[0015] 進一步的，所述顯色液含有750mM巧黃綠素和5mMMnClz的溶液。
[0016] 一種猴逆轉錄病毒的RT-LAMP檢測方法，包括如下步驟： O待檢樣品RNA的提取； 2) 利用權利要求1的引物組對待檢樣品進行反轉錄環介導等溫擴增反應； 3) 結果分析：根據反應液顏色變化判定結果，澄色為陰性，綠色為陽性； 進一步的，步驟2)反轉錄環介導等溫擴增反應的25 反應體系含有：SRV-F3 0. 2yM，SRV-B3 0. 2yM，SRV-FIP1. 6yM，SRV-BIP1. 6yM，RT-LAMP反應液 12. 5"，DNA聚合酶8U，逆轉錄酶2.抓，待檢RNA1~10化g，顯色液2. 5y1，用DEPC水補齊到25y1 ;然 后于63~65°C反應45~60min。
[0017] 上述檢測方法用于非疾病檢測或診斷。
[0018] 本發明的有益效果是： 本發明具有高特異性、高靈敏度、快速高效、操作簡便、結果易讀等有益效果： O高特異性： 本發明根據猴逆轉錄病毒（SRV) (GenBank登錄號為M11841. 1)的主要包膜蛋白基因 (ecK)的部分序列設計了 4條特異性引物，應用上述4條引物，擴增祀序列的6個區域，6個 區域中任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故其特異性極高，且非常穩定，形成引 物二聚體概率低，保證了反應的順利進行； 2) 高靈敏度：最低檢測極限可達到Ifg/y1含SRV目標片段的質粒DNA; 3) 快速高效：整個擴增只用45~60min即可完成，擴增產量可達IO9~10 1°個拷貝； 4) 操作簡便：不需要復雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預先進行反轉錄等繁瑣步 驟，只需要恒溫水浴鍋即可反應，條件比較溫和； 5)結果易讀：通過肉眼觀察反應管內顏色變化即可判讀檢測結果，無需電泳等其他任 何分析步驟，適合非專業人:t的現場檢測。
【附圖說明】
[0019] 圖1是實施例3特異性的檢測結果圖（1:SRVRNA;2:SIVRNA;3:HTLVRNA;4 : DEPC水對照）； 圖2是實施例4靈敏度的檢測結果圖（53￥0臟，1:100口邑/^1質粒0臟61?￥);2:10口邑/ 質粒DNA(SRV) ;3:Ipg/質粒DNA(SRV) ;4:IOOfg/質粒DNA(SRV) ;5:IOfg/ 質粒DNA(SRV) ;6:lfg/yl質粒DNA(SRV) ;7:0.1fg/yl質粒DNA(SRV) ;8:DEPC水對照）。
【具體實施方式】
[0020] W下結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0021] 實施例1猴逆轉錄病毒RT-LAMP檢測試劑盒的建立 猴逆牽專錄病毒的RT-LAMP(ReverseTranscription曰ndLoop-mediatedIsotherm曰I Amplification,反轉錄環介導等溫擴增反應）檢測試劑盒，包括RT-LAMP引物組、RT-LAMP 反應液、化迅NA聚合酶、逆轉錄酶、陽性對照和陰性對照、顯色液。
[0022] (1)RT-LAMP引物設計：W猴逆轉錄病毒（SRV)的主要包膜蛋白基因（ecK)為祀基 因，利用軟件在線設計SRV特異性R