一種新孢子蟲病檢測試劑盒的制作方法
【專利說明】-種新抱子蟲病檢測試劑盒 發明領域
[000。 本發明屬于分子生物學檢測技術領域，是設及一種基于3D數字PCR標量陽性對照 建立的新抱子蟲病巧ea^TimePCR)檢測試劑盒，用于不同動物感染新抱子蟲病的臨床診 斷和日常監測。
【背景技術】
[0002] 新抱子蟲病（Neosporiasis)是1998年新發現的一種原蟲病。病原為犬新抱子蟲 (Neosporacaninum)，寄生于多種哺乳動物有核細胞內，可導致妊娠母畜發生流產、弱產、 死胎等，新生仔畜發生運動障礙和神經系統疾病等，牛對該病尤為靈敏。犬是新抱子蟲的終 末宿主兼中間宿主，牛、馬、羊、鹿等家畜及多種野生動物均可W作為其中間宿主，健康動物 通過吞食被新抱子蟲抱子化卵囊或速殖子污染的水或飼草而發生水平感染，胎兒及仔畜主 要通過胎盤而發生垂直感染，垂直感染是該病的主要傳播方式。新抱子蟲感染后主要寄生 于宿主動物的腦、脊髓、神經和內臟等組織中。據報道，該病在世界范圍內牛類動物中的感 染率為10 %~40 %，最高達82 % ;我國新疆、青海、北京、吉林等地也有該病的報道，其感染 率為11. 8%~25. 4%不等。每年由該病導致的繁殖障礙性疾病給畜牧業生產造成了巨大 的經濟損失。目前，還沒有可用于防治該病的有效疫苗和特效藥物，準確的檢測、監控技術 結合患畜淘汰等措施是綜合防治該病的關鍵。
[0003] 傳統的免疫組織化學技術、超微結構檢測技術、病原分離技術等方法過程冗長、操 作繁瑣，不適用于該病的檢測。目前，用于檢測該病的方法主要有血清學方法檢測抗體和分 子生物學方法檢測病原DNA。血清學方法在蟲體感染早期的檢測效果欠佳，本研究運用分 子生物學方法著力于研制新抱子蟲病Real-TimePCR檢測試劑盒，用于早期感染和隱性"帶 蟲"階段的蟲體DNA檢測，與新抱子蟲病巧LISA抗體檢測試劑盒形成優勢互補，為新抱子蟲 感染全程的臨床診斷和日常監測提供科學的技術支撐。
[0004] 近年研究發現，由化SRS2基因編碼的P43蛋白是最有希望成為新抱子蟲病的診斷 抗原和免疫疫苗之一。實時巧光定量PCR技術巧ea^TimePCR)具有靈敏度高、特異性強、 穩定性好、方便快捷等特點，已被廣泛運用于各種病原的定性和定量檢測。其中，化qman MGB探針3'端能準確結合到DNA雙鏈小溝部，相對于其他探針具有更好的特異性、靈敏性和 穩定性。3D數字PCR技術（3DDigitalPCR)是美國ABI公司于2008年新研發的基于單 拷貝模板擴增而設計的一項新型絕對定量分析技術，它是通過PCR擴增和收集發生的巧光 信號讀取陽性反應數，再根據泊松分布計算出陽性模板DNA分子數。結合3D數字PCR技術 建立實時巧光定量PCR(Real-TimePCR)檢測方法，無需依賴陽性核酸標準品和Real-Time PCR擴增曲線的循環闊值（Ct)即可實現對擴增模板進行絕對定量分析。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的：為與新抱子蟲病巧LISA抗體檢測試劑盒的檢測效果形成優勢互 補，本發明通過設計檢測引物和巧光探針，結合3D數字PCR系統絕對定量分析，通過優化反 應體系和循環條件，建立新抱子蟲病Real-TimePCR檢測方法。并建立一種基于3D數字PCR 標量的新抱子蟲病Real-TimePCR檢測試劑盒，用于新抱子蟲病的臨床診斷和流行病學監 測。
[0006] 本發明的技術方案如下：為實現上述目的，發明人下載GenBank數據庫中已報道 的不同國家和地區的新抱子蟲化SRS2基因序列，通過DNAMAN軟件分析下載序列的同源性， 找出特異性的保守祀序列，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 4所示，將該祀序列作為檢測新抱子 蟲病的遺傳標記物。此外，本領域技術人員應當理解，該序列的特異性片段只可作為檢測新 抱子蟲病的遺傳標記物。
[0007] 設計檢測引物、巧光探針和獲得地方陽性目的基因片段 ①根據上述新抱子蟲化SRS2基因（登錄號：U93870. 1)保守序列設計檢測引物和MGB巧光探針。上游引物化SRS2F : 5 ' -TAGACGAATGTAAAGAACGCC-3 '，下游引物化SRS2R: 5' -CAAATAGATGGTCTGTGCTGTC-3';探針5'端標記FAM巧光報告基團，3'標記MGB巧光澤滅 基團，巧光探針化SRS2P為：5' -FAM-TTATTCCGCCGTGTTTC-MGB-3'。②運用PCR技術從地方 陽性樣品基因組DNA中擴增目的基因片段。NCSRS2F/R常規PCR反應體系為25yL : 10 X PCR Buffer(Mg2+plus)2. 5yL，dNTP(2. 5mM)2yL，hq DNA聚合酶巧U/yL)0. 15yL，上、下游 引物（lOpM)各IyL，模板DNAI.5yL，d地2〇補足25yL。擴增條件為：94°C預變性5min; 94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，35次循環；72°C延伸5min，擴增14化p的目的 基因片段。
[0008] 目的基因的克隆、測序 ①回收、純化擴增的目的基因片段連入祀ASY-BluntZeroClongVector,再轉入大腸 桿菌Transl-Tl感受態細胞中，經AmpYLB培養基擴大培養后，運用Plasmid化rification Kit提取菌體質粒，并對質粒進行PCR鑒定。②將PCR鑒定為陽性的重組質粒和克隆菌送 至北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司測序，測序結果與化SRS2基因（登錄號：U93870. 1) 序列進行相似性比對。
[0009] 建立新抱子蟲病實時巧光定量PCR (Real-Time PCR)檢測方法 ①3D數字PCR系統對提取的某一陽性質粒（32. 5ng/iiL)稀釋的10 6、10 \ 10 8滴 度進行絕對定量分析，W篩選引物、探針的最佳退火-延伸溫度和確定該質粒中實際參 與Real-TimePCR反應的模板濃度。3D數字PCR反應體系為15yL:2X3DMasterMix 7. 5化，引物、探針（IOpM)各1化，模板DNA2iiL，d地2〇補足15化。循環條件為：96°C預 變性IOmin;58°C退火-延伸2min，98°C變性30s，40次循環；60°C延伸2min。②均勻設計 法優化Real-TimePCR反應中模板濃度、引物濃度、退火-延伸溫度和延伸時間及擴增循環 數等參數。優化的Real-TimePCR反應體系為25yL:2XReal-TimePCRMix12. 5^以引 物、探針（I化M)各IyL巧光校正液0. 5yL模板DNA IyL(1地2〇補足25yL。循環條件 為：95°(：預變性5111111;95°(：變性153,58°(：退火-延伸453,45次循環。根據該反應條件建立 新抱子蟲病Real-TimePCR檢測方法標準曲線回歸方程。③運用優化的反應條件分別擴增 新抱子蟲、弓形蟲、牛環形泰勒蟲、牛己貝斯蟲和牛雙芽己貝斯蟲等蟲種陽性DNA，W評價其 特異性。④對該質粒的10°至10 9的每一稀釋滴度進行Real-TimePCR擴增，并比較常規 PCR和Real-TimePCR的檢測靈敏性。⑥重復3次對該質粒的IO3Copies/yLIO4Copies/ yL和IO5Copies/yL的稀釋滴度進行Real-TimePCR擴增，每個稀釋濃度均設計3個平行， 計算其組間、組內變異系數，W評價Real-TimePCR檢測方法的穩定性。
[0010] 新抱子蟲病Real-TimePCR檢測試劑盒的制備及使用 ①試劑盒用途：本試劑盒用于檢測家畜是否罹患新抱子蟲病，可準確檢測出家畜體內 新抱子蟲蟲體DNA，在初期感染和"帶蟲"階段的檢測效果特別準確，為新抱子蟲病的臨床檢 測和流行病學監測提供科學的技術支持。②試劑盒的原理：本檢測試劑盒采用實時巧光定 量PCR檢測技術巧ea^TimePCR)，根據GenBank中已發表的新抱子蟲化SRS2基因保守序 列設計檢測引物和MGB探針，建立新抱子蟲病Real-TimePCR檢測方法。結合3D數字PCR 檢測技術（3DDigitalPCR)篩選該檢測方法的最佳退火-延伸溫度和對最低有效檢測量 進行絕對定量分析。通過探討Real-TimePCR檢測方法特異性、靈敏性、穩定性和重復性等 特性，組裝新抱子蟲病Real-TimePCR檢測試劑盒用于檢測新抱子蟲病，該試劑盒適用于 Real-TimePCR系統擴增。③自備材料：實時巧光定量PCR(Real-TimePCR)系統；微量振 蕩離屯、機；96孔反應板或Real-TimePCR8聯管；移液器及吸頭等。
[0011] 樣本要求：樣本采集后應及時提取DNA，樣本DNA可參照DNA提取試劑盒或CTAB 法提取。若不能及時提取樣品可暫時儲存于-20°C冰箱中，2周內提取；提取的DNA儲存 于-20°C待檢