Ccdc59的激動劑在制備骨性關節炎藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物醫藥領域，具體設及CCD巧9的激動劑在制備骨性關節炎藥物中 的應用。
【背景技術】
[0002] 骨性關節炎（osteoarthritis,OA)是中老年人最常見的疾病之一，由于人群預期 壽命的延長，骨性關節炎的發病率也明顯增高，尤其是肥胖的老年人群，60歲W上人群中， 50 %W上在X線上有骨性關節炎表現。其常見病理改變為軟骨下骨硬化、關節周圍骨寶形 成、慢性滑膜炎，其引起的疼痛、功能障礙嚴重影響患者的生活質量。
[0003] 現有的骨性關節炎治療方法包括運動、藥物、休息和關節保健、手術、疼痛緩解技 術、替代治療和體重控制。治療骨性關節炎中常用的藥物包括非醬族抗炎藥如阿司匹林、布 洛芬等；直接用于皮膚的局部疼痛緩解乳膏、橡膠和噴霧劑等。可進行手術W使骨表面重 建、骨復位和置換關節。盡管各種藥物療法已被用于治療疾病，但是它們對長期控制和預 防是無效的。近年來研究發現在骨性關節炎的發生、發展的過程中多種細胞因子參與其病 理過程并起到非常重要的作用。參與骨性關節炎的細胞因子主要分為分解代謝相關細胞因 子、合成代謝相關細胞因子、炎性因子及一氧化氮、類花生酸類物質等其他細胞因子。運些 祀標的發現為骨性關節炎的治療提供了新思路。
[0004] 發明人對7例骨性關節炎滑膜組織及4例對照樣本進行高通量測序，結合生物信 息學方法進行基因篩選，挑選出候選基因CCD巧9,現有研究中并沒有CCDC59和骨性關節炎 相關的報道，進一步，發明人進行了分子生物學方法驗證，證實了CCDC59在骨性關節炎組 織中低表達，其激動劑可用于制備治療骨性關節炎藥物。本發明提供了一種新的骨性關節 炎的治療祀點，具有重要的臨床應用價值。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種骨性關節炎診斷制劑，所述骨性關節炎診斷制劑檢測 CCDC59基因和/或基因的表達產物。進一步的，所述的CCDC59基因和/或基因的表達產物 在骨性關節炎組織中低表達。
[0006] 進一步，所述骨性關節炎診斷制劑采用巧光定量PCR試劑盒、基因忍片、免疫方法 檢測骨性關節炎組織中CCDC59基因的表達。優選的，所述的巧光定量PCR試劑盒中含有一 對特異性擴增CCDC59基因的引物；所述的基因忍片中包括與CCDC59基因的核酸序列雜交 的探針。更優選的，巧光定量PCR試劑盒內含有特異性檢測CCDC59基因的上游引物和下游 引物，上游引物序列為SEQIDNO. 1，下游引物序列為SEQIDNO. 2。
[0007] 進一步，所述的骨性關節炎的診斷制劑采用免疫方法檢測骨性關節炎滑膜組織中 CCDC59基因的表達產物。優選的，所述免疫方法為化ISA檢測和/或膠體金檢測。進一步， 所述檢測CCDC59蛋白的ELISA法為使用ELISA檢測試劑盒。所述試劑盒中的抗體可采用市 售的CCDC59單克隆抗體或多克隆抗體。進一步，所述的試劑盒包括：包被CCDC59抗體的固 相載體，酶標抗體，酶的底物，蛋白標準品，陰性對照品，稀釋液，洗涂液，酶反應終止液等。 [000引進一步，所述檢測CCDC59蛋白的膠體金法為使用檢測試劑盒，所述的抗體可采用 市售的CCDC59單克隆抗體或多克隆抗體。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒采用膠體金免 疫層析技術或膠體金滲濾法。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區 (T)噴點有抗CCDC59抗體、質控區（C)噴點有免疫球蛋白IgG。
[0009] 本發明的目的在于提供上述骨性關節炎診斷制劑在制備骨性關節炎診斷工具中 的應用。
[0010] 本發明的目的在于提供一種治療骨性關節炎的制劑，所述制劑中含有促進CCD巧9 基因的轉錄或表達的試劑或化合物。進一步的，所述的CCDC59基因和/或基因的表達產物 在骨性關節炎組織中低表達。
[0011] 本領域人員熟知促進基因及其表達產物的表達通常可W采用下述方法中的一種 和/或幾種：激活分子標志物的啟動子、激活分子標志物表達的蛋白或因子、導入促進分子 標志物轉錄或表達的載體。
[0012] 優選的，所述治療骨性關節炎的制劑中含有促進CCDC59基因的轉錄或表達的載 體和/或激活CCDC59基因的啟動子和/或激活CCDC59基因表達的蛋白或因子。
[0013] 本發明的目的在于提供上述治療骨性關節炎的制劑在制備骨性關節炎治療藥物 或試劑中的應用。
[0014] 為實現上述目的，本發明首先通過高通量測序結合生物信息學方法篩選到候選基 因CCD巧9基因，進而通過分子生物學方法驗證了CCD巧9基因與骨性關節炎的關系：CCD巧9 基因與骨性關節炎具有很好的相關性，可用于制備骨性關節炎輔助診斷制劑，具有重要的 臨床應用價值。
[0015] 巧光定量PCR法是通過巧光染料或巧光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標 記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可W對產物進行分析，計算待測樣品模板 的初始濃度。巧光定量PCR的出現，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實現了絕對定 量。多種檢測系統的出現，使實驗的選擇性更強。自動化操作提高了工作效率，反應快速、 重復性好、靈敏度高、特異性強、結果清晰。
[0016] 基因忍片又稱為DNA微陣列值NAmicroarray)，可分為S種主要類型：1)固定在 聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或CDNA片段，通常用同位素標記 的祀基因與其雜交，通過放射顯影技術進行檢測。2)用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針 陣列，通過與巧光標記的祀基因雜交進行檢測。3)在玻璃等硬質表面上直接合成的寡核巧 酸探針陣列，與巧光標記的祀基因雜交進行檢測。基因忍片作為一種先進的、大規模、高通 量檢測技術，應用于疾病的診斷，其優點有W下幾個方面：一是高度的靈敏性和準確性；二 是快速簡便；=是可同時檢測多種疾病。
[0017] 酶聯免疫吸附實驗巧LISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標 記的抗原抗體反應在固相表面進行的技術。該技術可用于檢測大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標準化等優點。ELISA檢測試劑盒根據檢測目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾屯、法、競爭法、雙位點一步法、捕獲法測IgM抗體、應用親和素和 生物素的化ISA。ELISA檢測試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶（HR巧或者堿性憐 酸酶（AF0。
[0018] 常用的免疫膠體金檢測技術：（I)免疫膠體金光鏡染色法細胞懸液涂片或組織切 片，可用膠體金標記的抗體進行染色，也可在膠體金標記的基礎上，W銀顯影液增強標記， 使被還原的銀原子沉積于已標記的金顆粒表面，可明顯增強膠體金標記的敏感性。（2)免疫 膠體金電鏡染色法可用膠體金標記的抗體或抗抗體與負染病毒樣本或組織超薄切片結合， 然后進行負染。可用于病毒形態的觀察和病毒檢測。（3)斑點免疫金滲濾法應用微孔濾膜 作載體，先將抗原或抗體點于膜上，封閉后加待檢樣本，洗涂后用膠體金標記的抗體檢測相 應的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體W條帶狀固定在膜上，膠 體金標記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本 墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結合墊上的膠體金標記試劑后相互反應，當移動至固 定的抗原或抗體的區域時，待檢物與金標試劑的結合物又與之發生特異性結合而被截留， 聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結果。該法現已發展成為診斷試紙條，使用十分方 便。
[0019] 本發明的目的在于提供一種檢測骨性關節炎的基因檢測試劑盒，所述試劑盒檢測 基因CCD巧9,采用特異的上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQIDNO. 1，下游引物序 列為沈QIDNO. 2。
[0020] 進一步，該PCR試劑盒適合于目前存在市場上的所有類型巧光定量基因擴增儀， 靈敏度高，定量快速準確、穩定性好，具有良好的應用前景。
[002。 進一步，上述巧光定量PCR試劑盒組分包括：特異性引物、內參引物、巧光定量PCR反應液。所述內參為GAPDH。
[0022] 所述的試劑盒還包含RNA抽提試劑。
[0023] 本發明目的是提供了一種骨性關節炎蛋白檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒檢測 CCDC59蛋白。進一步的，所述的試劑盒還包括其他檢測試劑。
[0024] 本發明目的是提供了一種檢測骨性關節炎的基因忍片，所述的基因忍片包括與 CCDC59基因的核酸序列雜交的探針。
【附圖說明】
[0025] 圖1Westernblot測定滑膜組織中C