一種鑒定豬脊椎數相關性狀的方法及專用引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，設及一種鑒定豬脊椎數相關性狀的方法及專用引物。
【背景技術】
[0002] 豬脊椎數是豬的重要經濟性狀，脊椎數的變異可影響豬的體長，據報道，脊椎數量 每額外增加 1 節，體長可增加約8cm(KingJWB,Robe;rtsRC.Carcasslengthinthebacon pig:itsassociationwithvertebraenumbersandpredictionfromradiographsof theyoungpig.AnimProd. 1960, 2:59-65.)。豬的脊椎可分為頸椎、胸椎、腰椎、薦椎和尾 椎，其中胸椎和腰椎在不同豬種中存在變異，其它椎體數量固定，因此，一般提到脊椎數是 指胸腰椎數。中國地方豬種的脊椎數一般有19-20節，而西方商業豬種一般有20-22節 (MikawaS,HayashiT,NiiM,ShimanukiS,MorozumiT,AwataT.Twoquantitativetrait locionSusscrofachromosoneslandTaffectingthenumberofvertebrae.JAnim Sci. 2005, 83:2247-2254.)。因此，影響脊椎數變異的主效基因研究成為了研究熱點之一。
[0003] 基于豬脊椎數相關性狀的重要性，針對其開展育種工作成為當前育種工作的一個 重點。但是，由于傳統育種方法速度慢、準確程度低，分子育種W其準確性和快速性等特點 已經成為當前育種工作的主要技術手段。
【發明內容】
[0004] 本發明的第一個目的是提供一種與豬脊椎數相關的SNP位點及其應用。
[0005] 本發明所提供的應用具體可為如下中的任一種：（1)豬基因組中如下SNP位點的 單核巧酸多態性在鑒定或輔助鑒定待測豬的脊椎數相關性狀中的應用；（2)用于檢測豬基 因組中如下SNP位點的單核巧酸多態性的物質在鑒定或輔助鑒定待測豬的脊椎數相關性 狀中的應用。
[0006] 所述SNP位點為：W豬基因組DNA為模板，采用由序列表中序列1所示的單鏈DNA 和序列表中序列2所示的單鏈DNA組成的引物對進行PCR擴增所得擴增產物的自5'末端 起第118位核巧酸；所述SNP位點處的核巧酸為A或G。
[0007] 該SNP位點位于TGFB3基因內，具體為國際豬基因組10. 2版本參考序列7號染色 體上第105182819個核巧酸位點A〉G突變（記為g. 105182819A〉G)。
[0008] 本發明的第二個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定待測豬的脊椎數相關性狀 的試劑。
[0009] 本發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定待測豬的脊椎數相關性狀的試劑，是用于檢 測豬基因組中SNP位點（g. 105182819A〉G)的單核巧酸多態性的物質；
[0010] 所述"用于檢測豬基因組中如下SNP位點的單核巧酸多態性的物質"可W能夠鑒 定SNP位點（g. 105182819A〉G)的單核巧酸多態性的任何物質，如為如下（a)或化）所示的 引物對： 1] (a)由序列表中序列1所示的單鏈DNA和序列表中序列2所示的單鏈DNA組成的 引物對；
[0012] (b)由將序列表中序列1和序列2經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/ 或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與（a)中所述引物對功能相同的引 物對。
[0013] 本發明的第=個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定待測豬的脊椎數相關性狀 的試劑盒。
[0014]本發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定待測豬的脊椎數相關性狀的試劑盒，含有所 述試劑。
[0015] 所述試劑或所述試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測豬的脊椎數相關性狀中的應用也 屬于本發明的保護范圍。
[0016]本發明的第四個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測豬的脊椎數相關性狀的方 法。
[0017] 本發明所提供的鑒定或輔助鑒定待測豬的脊椎數相關性狀的方法，具體可包括如 下步驟：檢測待測豬的基因組中SNP位點（g. 105182819A〉G)處的核巧酸為A還是G還是A 和G，W確定所述待測豬的基因型是AA還是GG還是AG,根據所述待測豬的基因型按照如下 確定待測豬的脊椎數相關性狀：GG基因型的待測豬的脊椎數多于或候選多于AG基因型的 待測豬；AG基因型的待測豬的脊椎數多于或候選多于AA基因型的待測豬；
[0018] 所述GG基因型為W豬基因組DNA為模板，采用由序列表中序列1所示的單鏈DNA 和序列表中序列2所示的單鏈DNA組成的引物對進行PCR擴增所得的擴增產物的自5'末 端起第118位核巧酸為G的純合型（即國際豬基因組10. 2版本參考序列7號染色體上第 105182819個核巧酸為G的純合型）；即擴增產物只有一種，為序列表中序列4所示DNA片 段。
[0019] 所述AA基因型為W豬基因組DNA為模板，采用由序列表中序列1所示的單鏈DNA 和序列表中序列2所示的單鏈DNA組成的引物對進行PCR擴增所得擴增產物的自5'末 端起第118位核巧酸為A的純合型（即國際豬基因組10. 2版本參考序列7號染色體上第 105182819個核巧酸為A的純合型）；即擴增產物只有一種，為序列表中序列3所示DNA片 段。
[0020] 所述AG基因型為W豬基因組DNA為模板，采用由序列表中序列1所示的單鏈DNA 和序列表中序列2所示的單鏈DNA組成的引物對進行PCR擴增所得擴增產物的自5'末端 起第118位核巧酸為A和G的雜合型（即國際豬基因組10. 2版本參考序列7號染色體上 第105182819個核巧酸為A和G的雜合型）；即擴增產物有兩種，分別為序列表中序列3所 示DNA片段和序列表中序列4所示DNA片段。
[OOW 在所述方法中，所述"檢測待測豬的基因組中如下SNP位點處的核巧酸為A還是G 還是A和G"的方法可為測序分析；所述測序分析可包括PCR擴增和對所述PCR擴增所得產 物進行測序兩個步驟；所述PCR擴增的模板為所述待測豬的基因組DNA，所用的引物對滿足 如下條件：W待測豬的基因組DNA為模板進行PCR擴增所得擴增產物含有所述SNP位點處 的核巧酸；
[0022] 具體的，所述引物對可為如上所述（a)或所述化）所示的引物對。
[002引當采用所述引物對（序列1和序列2)進行PCR擴增時，根據待測豬的基因組DNA 的不同，擴增得到的DNA片段如序列表中序列3所示或如序列表中序列4所示。其中，序列 3的第118位核巧酸為A;序列4的第118位核巧酸為G。
[0024] 所述試劑或所述試劑盒或所述方法在豬育種中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0025] 在所述方法中，進行所述PCR擴增時采用的退火溫度為56-60°C(如58. 5°C)。
[0026] 進一步，進行所述PCR擴增時采用的擴增程序具體為：95°C預變性5min;95°C變性 20s，58. 5°C退火30s，72°C延伸30s，共35個循環；最后72°C延伸lOmin。
[0027] 進一步，所述PCR反應體系具體為：模板DNA200ng，IOXPCR擴增緩沖液5y1， dNTPs終濃度為IOmM,上、下游引物各50ng，TaqDNA聚合酶0. 75U，Mg2么5臟〇1/1，用d地2〇 補足體系至50Ji1。
[0028] 本發明的第五個目的是提供如下（A)或度）的方法：
[0029] (A)培育多脊椎數的豬的方法，包括選擇GG基因型的豬進行育種的步驟；所述GG 基因型為W豬基因組DNA為模板，采用由序列表中序列1所示的單鏈DNA和序列表中序列2 所示的單鏈DNA組成的引物對進行PCR擴增得到的擴增產物的自5'末端起第118位核巧 酸為G的純合型（即國際豬基因組10. 2版本參考序列7號染色體上第105182819個核巧 酸為G的純合型）；
[0030] 做培育少脊椎數的豬的方法，包括選擇AA基因型的豬進行育種的步驟；所述GG 基因型為W豬基因組DNA為模板，采用由序列表中序列1所示的單鏈DNA和序列表中序列2 所示的單鏈DNA組成的引物對進行PCR擴增得到的擴增產物的自5'末端起第118位核巧 酸為A的純合型（即國際豬基因組10. 2版本參考序列7號染色體上第105182819個核巧 酸為A的純合型）。
[0031] 在本發明中，所述豬為大民雜交豬；所述大民雜交豬具體由大白豬和民豬雜交得 到。
[0032] 在本發明中，所述脊椎數是指胸椎數和腰椎數的總和。
[0033] 實驗證明，GG基因型的豬的脊椎數顯著大于AG基因型的豬的脊椎數，AG基因型 的豬的脊椎數顯著大于AA基因型豬的脊椎數，GG基因型豬的脊椎數比AA基因型豬的脊椎 數多約0. 66節（P<0. 001)。所WSNP位點（g. 105182819A〉G)可作為豬脊椎數相關性狀的 分子育種標記。本發明提供的方法可對待選豬進行早期篩選，有效地解決實際生產中的選 取優良種豬時間長的問題，降低了育種花費，有效減少或增加實際生產中的豬的脊椎數，該 方法準確度高，檢測費用低，并可實現自動化檢測，在豬的育種方面具有很高的實踐應用價 值。
【附圖說明】 W34] 圖1為AA基因型個體（對應序列扣和GG基因型個體（對應序列4)豬TGFB3基 因g. 105182819A〉G多態性位點附近序列的測序結果。
【具體實施方式】
[0035] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0036] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0037] 下述實施例中的大民雜交豬（Susscro化)，由大白豬和民豬雜交獲得，具體為大 白豬X民豬的F2代，按照文獻中的方法獲得：Luo W，化eng化化en S，Wang LLi Y，Ma X，Song X，Liu X，Li W, Liang J, Yan H, ZhaoK, Wang C, Wang L, Zhang L. Genome-wide association analysis of meat quality traits in a porcine Large WhiteXMinzhu intercross population. Int J Biol Sci.2012, 8:580-595。具體方法如下：四頭大白豬分 別交配16頭民豬，獲得Fl代群體，此Fl代群體中的9頭公豬交配46頭母豬，=個胎次共 生產了 592頭F2代個體。
[003引