用于胃癌診斷的miRNA生物標志物及檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物檢測，具體設及用于人胃癌診斷的microRNA生物標志物及檢測 試劑盒。
【背景技術】
[0002] 胃癌作為全球第四大癌癥，嚴重威脅到人類健康。世界每年胃癌新發病例近百萬， 發展中國家占近2/3,其中42%發生在中國。胃癌的早期診斷與治療對患者的病情及預后 至關重要，也是國內胃癌領域有待突破的主要研究方向。胃癌的發生發展設及多基因異常 調控、多步驟參與，最終使細胞生物學行為由正常演變為異常。當細胞行為異常是基于基因 水平發生變化時，便可引發細胞結構和功能的不可逆性改變，很大可能造成細胞癌變。
[0003] 實現胃癌的早期診斷可W大大提高患者長期生存率及生活質量。目前常用的癌癥 診斷方法有病理學診斷、物理學診斷和血清學檢查癌癥相關標志物等，運些方法是在細胞 及其代謝物水平進行篩查，對于診斷出陽性結果的患者，體內已出現細胞癌變及癌細胞的 異常增殖，嚴格意義上看并非屬于癌癥的早期診斷。最新研究較多關注癌癥的基因診斷與 治療，基因診斷著眼于細胞基因水平的變化，在細胞形態與功能改變之前進行探索，使得癌 癥的早發現與早治療成為可能。目前胃癌的基因診斷主要有胃癌特異癌基因的檢測及胃癌 相關病因檢測。
[0004]MicroRNA(IIiiRNA)是最新發現的長約18-25個核巧酸的非編碼小分子RNA，在進 化上高度保守，數量約占基因組的1 %，現已普遍認為miRNA與人類疾病的發生有密切的聯 系，其發現為人們在基因水平認識癌癥提供了新思路。MiRNA在轉錄或轉錄后水平負調控蛋 白質編碼基因的表達：通過與其祀基因mRNA非完全互補或近似完全互補結合，導致mRNA降 解或抑制其翻譯。人類基因組約30%的基因受miRNA調控，在細胞的生長、增殖、分化和調 亡等多方面發揮著重要的生物調節作用。研究已證實miRNA的異常調控與腫瘤形成及進展 關系密切。MiRNA的祀基因多數是參與轉錄、信號轉導、腫瘤發生等生物學效應的基因。隨 著miRNA與癌癥關系的不斷深入研究，發現miRNA并不只是參與了癌癥形成的初期階段，還 設及到疾病病情變化、對藥物的敏感性、患者預后等等多方面。隨后基于miRNA的癌癥基因 治療順勢登上舞臺，凸顯出很大的研究價值。
[0005]MiRNA在胃癌中的研究顯示了miRNA在胃癌診治中的研究價值及應用前景。不少 文獻已掲示了特定miRNAs在胃癌發生發展中的作用。化nLuGunLu,etal. 2005)等對 人類多種癌癥中的microRNA表達做了分析，發現miRNA表達譜可用于區分診斷不同類型 的癌癥。他們發現胃腸道癌癥（胃癌、結腸癌等）的miRNA表達譜聚集在一起，與其它類 型癌癥miRNA表達譜距離很遠，可W區分癌細胞的大致來源。Xiao狂iaoB，etal. 2009) 等研究顯示胃癌與正常組織中miRNA存在差異，同時發現癌癥組織中miR-106a水平要高 于非癌癥組織，并且miR-106表達水平的變化與腫瘤分期、腫瘤大小及分化程度等特性相 關，提示miR-106a可作為胃癌診斷及病情預測的潛在標志物。運些研究為尋找胃癌特異性 miRNA作為胃癌診斷生物標記物提供幫助。在胃癌侵襲和轉移方面，Song燈ongxiSong,et al. 1999)等研究顯示胃癌組織中miR-194的表達量與胃癌的侵襲程度成反比。他們發現IV型胃癌患者腫瘤組織中miR-194表達量比型的表達量低；體外侵襲實驗證實轉染 了miR-194模擬物的胃癌細胞株侵襲率降低，提示miRNA的表達量與癌癥病情進展相關。亦 有研究顯示miRNA在胃癌中的異常改變與癌癥的預后相關。2009年的一項研究分析了 100 名胃癌患者miRNA表達譜，篩選出一組含7個異常miRNAs的表達譜，可作為獨立預測患者 預后的相關指標，其預測率在后續的50名胃癌患者得到進一步驗證狂Li,etal. 2009)。提 示對于miRNA在胃癌中的研究，有助于提供胃癌診斷、病情判斷、預后評估等多方面信息。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供用于胃癌診斷的microRNA生物標志物及檢測試劑盒。
[0007] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得W實現的：
[0008] -組用于人胃癌診斷的microRNA生物標志物，所述microRNA生物標志物由如 下microRNA組成：has-miR-lOb-Sp、has-miR-lOO-Sp、has-miR-206、has-miR-155-5p 和has-miR-224-5p;所述has-miR-10b-5p的核巧酸序列如沈QIDNO.I所示；所述 has-miR-100-5p的核巧酸序列如沈QIDNO. 2所示；所述has-miR-206的核巧酸序列 如SEQIDNO. 3所示；所述has-miR-155-5p的核巧酸序列如SEQIDNO. 4所示；所述 has-miR-224-5p的核巧酸序列如沈QIDNO. 5所示。
[0009] 進一步地，所述microRNA生物標志物為人血清microRNA生物標志物。
[0010] 所述的microRNA生物標志物在篩選人胃癌的腫瘤診斷藥物中的用途。
[0011] 一組人胃癌診斷用microRNA引物、探針的組合，所述microRNA引物、探針的組合 包括：has-miR-10b-5p引物、探針；has-miR-100-5p引物、探針；has-miR-206 引物、探針； has-miR-155-5p引物、探針；has-miR-224-5p引物、探針。
[0012] 進一步地，所述microRNA引物包括反轉錄引物、定量PCR前引物和定量PCR后引 物。
[0013] 進一步地，11日3-11111?-1013-5口的反轉錄引物序列如569 10^.6所示，定量口〇?前引 物序列如沈Q IDNO. 7所示，定量PCR后引物序列如沈Q IDNO. 16所示；has-miR-100-5p 的反轉錄引物序列如SEQIDNO.8所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.9所示，定量 PCR后引物序列如SEQIDNO. 16所示；has-miR-206的反轉錄引物序列如SEQIDNO. 10所 示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO. 11所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO. 16所示； has-miR-155-5p的反轉錄引物序列如SEQIDNO. 12所示，定量PCR前引物序列如SEQID NO. 13所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO. 16所示；has-miR-224-5p的反轉錄引物序 列如SEQIDNO. 14所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO. 15所示，定量PCR后引物序列 如沈Q IDNO. 16所示；各microRNA探針的核巧酸序列如沈Q IDNO. 17所示。
[0014] 所述的人胃癌診斷用microRNA引物、探針的組合在制備或篩選人胃癌的腫瘤診 斷藥物中的用途。
[0015] 一種人胃癌的腫瘤診斷試劑盒，包括所述的miRNA引物、探針的組合。
[0016] 進一步地，所述的人胃癌的腫瘤診斷試劑盒還包括逆轉錄酶、緩沖液、dNTPs、 MgClz、DEPC水、Taq酶W及標準品和/或對照品。
[0017] 本發明的優點：
[0018] 本發明將胃癌與癌旁組織表達差異明顯（差異表達量大于2個化Id,RT-PCR中CT 值小于 30)的 5 種miRNAhas-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-155-5p、has-miR-206 及has-miR-224-5p進行血清學表達分析，結果表明運5種miRNA在血清中穩定表達，血清 miRNA的表達與組織具有很好的一致性，has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p和has-miR-206 表達下調，has-miR-155-5p和has-miR-224-5p表達上調。運5種miRNA可W作為胃癌診 斷的生物標志物，且聯合診斷的靈敏度與特異性顯著高于單一miRNA診斷的靈敏度和特異 性。
【附圖說明】
[0019]圖 1-圖 5 分別顯示has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-206、 has-miR-155-5p和has-miR-224-5p單獨用于區分胃癌樣本和正常對照的ROC曲線；
[0020] 圖6顯示為has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-206、has-miR-155-5p和 has-miR-224-5p聯合用于區分胃癌樣本和正常對照的ROC曲線。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不W此限定本發明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可W對 本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。實施 例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如教科書和實驗指南中所述的條 件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0022] 實施例1 :胃癌組織差異性miRNA的篩選
[002引 1對象和方法
[0024] 1. 1標本來源
[00巧]在取得患者知情同意后，收集南京鼓樓醫院2013年1月-2014年1月經病理證實 為胃癌患者手術后標本8對，包括癌組織標本W及配對的距離癌組織3厘米W上范圍的癌 旁組織，所有患者在術前均未接受過化療和放療。
[0026] 1. 2主要儀器設備
[0027]臺式離屯、機：E卵endo;rfMinispin(美國化卵endo;rfcentrifuge5810R(美國）
[0028]核酸濃縮儀：E卵endo;rfconcentrator5301 (美國）
[0029] 紫外分光光度計：DU640、天平度ec