基于未修飾納米金與雙鏈dna相互作用的比色法檢測dna的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種基于未修飾納米金與雙鏈DNA相互作用的新型比色法檢測DNA。
【背景技術】
[0002] 近年來，生物、醫學、化學、物理等學科領域的研究人員都對納米金產生了濃厚的 興趣。與常規的宏觀粒子比較，納米金具有非常獨特的物理化學性質W:(l)納米金易于 制備；（2)具有納米顆粒所特有的小尺寸效應、表面效應；（3)具有獨特的電學效應、光學 效應、磁學效應、催化效應和特殊的生物親和效應。運些效應使得金納米粒子廣泛應用于臨 床、材料學等領域，在醫學檢驗領域金標記技術已經成為目前的第四大標記技術。
[0003] 用巧樣酸鋼還原氯金酸法制備出的納米金由于表面吸附了帶負電荷的巧樣酸根 離子而相互排斥，在溶液中處于均勻分散的穩定狀態，顏色呈透亮的酒紅色。但若加入一 定量的鹽，穩定狀態即被打破，納米金發生團聚，粒子間距小于平均粒子直徑，導致溶液顏 色很快由紅色轉為紫色最后呈藍灰色溶液顏色，而且運種變化是不可逆的。基于運個原理 發展了一系列的納米金檢測DNA的方法，可歸納為兩種。
[0004] 一是修飾的納米金檢測技術；納米金上通常修飾有單鏈DNA(ssDNA)，如果此 ssDNA與待檢測DNA相匹配而形成雙鏈，顏色發生轉變W。運種方法也存在不足，如納米金 團聚的時間太長，修飾的過程比較費時。在金納米粒子表面修飾的物質如抗體、DNA、半脫氨 酸等都是通過Au-S鍵結合的，運些帶琉基的物質價格都比較貴、難W獲得。
[000引二是未修飾的納米金檢測技術；Li和RothbergW指出，未修飾的納米金對單鏈DNA(ssDNA)和雙鏈DNA(dsDNA)有不同的靜電作用。ssDNA的單鏈具有足夠的柔初性 在溶液中得W部分展開，使其堿基暴露，堿基帶正電，與帶負電的納米金通過靜電作用力相 結合，能吸附在納米金上。在加入鹽溶液后，ssDNA保護納米金不聚集，顏色保持紅色。而 dsDNA由于帶負電與納米金相互排斥，不能吸附在納米金上，在加鹽后顏色變成藍色至灰 色。此方法價格低廉，不需要額外的檢測儀器，檢測方法簡單。通過利用運一原理，化SUb Lee在其文章中成功利用未修飾的納米金檢測了點突變W。
[0006] 現有的未修飾的納米金檢測DNA看似簡單可行，價格低廉，但實際應用并不廣泛。 此原理2004年被提出，但截至2015年，只利用此原理檢測實際樣品的做法很少。本發明希 望找出其中的問題所在。而其余的DNA檢測方法，如瓊脂糖電泳，污染環境，操作繁瑣；而如 qPCR費用昂貴，要使用特殊昂貴的儀器，不便推廣。
[0007] 上述設及到的參考文獻如下：
[1] 姚素薇，鄒毅，張衛國.金納米粒子的特性、制備及應用研究進展[J].化工進 展，2007 (03) :310-314.
[2] 李靜.納米金比色法檢測克倫特羅和凝血酶[M]:陜西師范大學，2012:68
[3] Li,比，Rothbe巧.，L.，2004.PNAS. 101，14036-14039.
[4] Lee,比，Kang,T.,Yoon,K.A.,Lee,S.Y.,Joo,S.W.,Lee,K., 2010b. Biosens.Bioelectron. 25巧），1669-1674。
【發明內容】
[0008] 為了解決上述存在的問題，本發明探討了dsDNA與未修飾的納米金之間的相互作 用，找到了能運用于實際的未修飾納米金檢測DNA的方法。本發明利用未修飾納米金與 dsDNA相互作用的性質，建立一種快速簡單，無需用到額外的儀器（肉眼可見)，不污染環境， 結果可靠，靈敏度高的新型檢測方法。
[0009] 本發明所采取的技術方案是： 一種檢測雙鏈DNA的方法，包括W下步驟：將待測樣品加入含有未修飾的納米金的溶 液中，混勻，再加入鹽，混勻，若溶液顏色仍然保持紅色說明樣品中含有雙鏈DNA。
[0010] 進一步的，上述鹽為能夠使納米金發生聚團的鹽。
[0011] 一種檢測基因點突變的方法，包括W下步驟： 1) 根據需要檢測的基因，對待測樣品DNA進行等位特異性PCR擴增，PCR的引物根據突 變位點設計，只能擴增出發生點突變的基因； 2) 將PCR擴增產物加入含有未修飾納米金的溶液中，混勻，再加入鹽，混勻，若溶液顏 色保持紅色說明該樣品發生了相應的基因點突變。
[0012] 本發明的有益效果是： O本發明發現了dsDNA能吸附于未修飾的納米金上。
[0013] 2)本發明基于dsDNA能吸附于未修飾的納米金的原理，建立的新型比色法檢測 DNA。
[0014] 3)本發明基于dsDNA能吸附于未修飾的納米金的原理建立了BRAFV600E的點突 變檢測。同時此方法可W推廣至各種點突變的檢測，及病毒檢測。
[0015] 4)本發明方法快速簡單，無需用到額外的儀器（肉眼可見)，不污染環境，結果可 靠，靈敏度高的新型檢測DNA的方法。
【附圖說明】
[0016]圖1為納米金的表征，其中A為納米金的TEM圖，B為納米金的紫外光譜圖； 圖2為dsDNA與未修飾納米金之間相互作用的研究。A為各組溶液中羅丹明B的巧光 發射光譜圖；B為各組溶液中dsDNAz的巧光發射光譜；C為羅丹明B(RB)、dsDNAi和納米金 (AuNPs)相互作用巧光強度變化原理圖，其中實屯、球體表示納米金；D為dsDNAz和納米金 (AuNPs)相互作用巧光強度原理圖，其中實屯、球體表示納米金，G為連在dsDNAz5'的巧光 分子羅丹明綠. 圖3為dsDNAz溶液體系與納米金溶液巧光滴定圖，A為在溫度308K時的巧光滴定圖， 其中1~5曲線對應的納米金溶液濃度分別為0molL1、0. 98X10 1°molL1、1. 96X10 1° molL1、29. 4X10"molL1、3. 9X10"molLSb為dsDNA2與納米金的Van't-Hoff圖； 圖4為未修飾的納米金檢測dsDNA的結果圖，A為不同濃度的dsDNAi與納米金溶液混 合后的顏色變化情況；B為未修飾的納米金比色法檢測dsDNA原理圖； 圖5 (A)未修飾的納米金檢測BRAFV600E突變的結果圖和度）各細胞的直接測序的 結果圖。
【具體實施方式】
[0017] 一種檢測雙鏈DNA的方法 1) 準備好未修飾納米金溶液； 2) 將待測樣品加入未修飾納米金溶液中，混勻； 3) 往上述混合液中再加入鹽，混勻后，若溶液顏色仍然保持紅色說明樣品中含有雙鏈 DNA。
[0018] 優選的，步驟1)中未修飾納米金溶液的濃度為達到肉眼可識別其顏色為紅色即 可，更優選的，未修飾納米金溶液的濃度為0. 37nM及W上；更優選的納米金濃度為0. 37 nM~2. 46nM。
[0019] 上述未修飾的納米金粒徑使納米金溶液肉眼可見呈紅色即可，本發明實施例所用 納米金粒徑為17. 5皿。
[0020] 優選的，上述步驟2)中待測樣品與未修飾納米金溶液的體積比為1 : (1~50)。該 體比可根據納米金粒徑的不同、納米金濃度的不同、DNA序列長度的不同、鹽的用量等具體 情況進行適當的改變。
[0021] 優選的，上述步驟3)中所述的鹽為能夠使納米金發生聚團的鹽。
[0022] 優選的，上述步驟3)中鹽在如為化Cl溶液，其加入量為使鹽的終濃度為0. 05M。
[0023] 一種檢測基因點突變的方法 1) 根據需要檢測的基因，對待測樣品DNA進行等位特異性PCR擴增，即PCR的引物根據 突變位點設計，只能擴增出發生點突變的基因； 2) 將PCR擴增產物加入含有未修飾納米金的溶液中，混勻，再加入鹽，混勻，若溶液顏 色保持紅色說明該樣品發生了相應的基因點突變。
[0024] 下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[00巧]實施例1dsDNA與未修飾的納米金表面具有吸附結合作用 1.納米金的合成與表征 方法：將圓底燒瓶中加入95血超純水，1血1%氯金酸，磁力攬拌下加熱至100。開始沸 騰后迅速一次性加入4ml1%巧樣酸S鋼，充分攬拌并在100°C下保持沸騰至溶液呈酒紅色 后加熱20min，自然冷卻至室溫，所得溶液即為納米金溶膠，于4°C下避光保存備用。
[0026] 利用透射電子顯微鏡（TEM)對膠體金溶液的形貌和粒子大小進行觀察；把制備的 溶膠樣品直接滴在鍛有碳膜的銅網上，紅外燈下干燥30min后，放入透射電鏡樣品臺拍攝 TEM圖像，操作電壓為200kV。采用紫外一可見分光光度法，在波長為450~600nm范圍內 測定金溶膠的吸收光譜，觀察其特征吸收曲線。
[0027] 結果：納米金的TEM圖像如圖IA所示，由TEM圖計算出納米金的粒徑為17. 5nm， 納米金的紫外光譜圖如圖IB所示，從中計算出納米金的濃度為2.71nM。
[0028] 的制備 雜交緩沖液為10ml化is(pH7. 5 - 8. 0)與50ml化Cl。把兩條不同序列的ssDNA加入雜交緩沖液中95 °C加熱5min后，逐漸冷卻至室溫即得dsDNA。dsDNAi由ssDNAi ssDNAz雜交制成，dsDNAz由ssDNAz與SSDNA3雜交形成，具體的堿基序列如表1所示。
[0029] 表1核巧酸序列表
注：;rhodaminegreen為羅丹明綠。
[0030] 與未修飾納米金間的相互作用 方法：羅丹明B能吸附在納米金表面而使其自身巧光被澤滅。本實驗檢測了W下四組 溶液中羅丹明B的巧光強度： a:羅丹明B; b:羅丹明B、dsDNAi和納米金（dsDNA1和納米金先混勻靜置IOmin再加入羅丹明B);C:羅丹明B和dsDNAi; d:羅丹明B和納米金； 上述四組溶液體積均為310化，納米金用量為20化，羅丹明B的終濃度均為3. 2X10 5mol?L，dsDNAi的終濃度為1. 29剛。羅丹明B巧光的激發波長為510皿。
[0031] 結果：上述a、b、c、d四組溶液中羅丹明B的巧光檢測結果如圖2A所示，從中可W 看出未加入dsDNAi和納米金的羅丹明B巧光強度最強（a);當溶液中含有dsDNA1 (C)或納 米金（d)時，羅丹明B的巧光強度均會變低，說明dsDNAi、納米金均能與羅丹明B相互作用， 澤滅羅丹明B的巧光；然而，將dsDNAi和納米金先混合后再加入到羅丹明B溶液中，dsDNA1 和納米金對羅丹明B巧光的澤滅能力下降，運說明dsDNAi與納米金發生了相互作用，導致 溶液中游離的納米金和dsDNAi減少，從而與羅丹明B結合的納米金和dsDNA1減少，即表現 出對羅丹明B巧光的澤滅能力下降。此原理可用圖2C作進一步解釋，當沒有dsDNA存在時， 納米金只和羅丹明B結合，當有dsDNA存在時，dsDNA與羅丹明B競爭性地與納米金結合， 與納米金結合的羅丹明B必須減少，從而減少對羅丹明B巧光的澤滅。
[0032] 方法：dsDNAz的5'有巧光分子羅丹明綠(見表1)，激發波長為489皿。本實驗檢 測W下兩組溶液的巧光強度： A:d