用于鑒別癭椒樹性別的引物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物分子生物技術領域，設及一種用于鑒別瘦椒樹性別的引物及其應 用。
【背景技術】
[0002] 瘦椒樹（Tapisciasinensis)，又稱銀醋樹，屬于瘦椒樹科（Tapisciaceae)、瘦椒 樹屬，為我國特有的珍稀、古老樹種。由于其種子發育周期長，自然更新能力差，加上人為破 壞，已處于溯危狀態，被列為國家=級保護植物。
[0003] 瘦椒樹為雄全異株的繁育系統，在種群中有雄株和兩性株兩種性別。雄株開雄花 不結果，兩性株開完全花并結果。雄全異株在自然界中極為罕見，其在植物繁育系統的進化 與維持方面具有獨特的研究價值。瘦椒樹的葉片內富含黃酬類化合物，具有明顯的抗潰瘍、 解疫、抗炎及降血脂等生物活性，在醫藥上應用廣泛。在園林綠化方面，瘦椒樹樹形美觀，秋 葉黃色，枝繁葉茂，又可作園林綠化樹種。因此，瘦椒樹是一種集科研、經濟、觀賞于一身的 珍稀樹種，是一種優良的種質資源。
[0004] 確定瘦椒樹早期的性別有助于研究雄全異株植物性別決定的遺傳原理，有助于理 解植物繁育系統的進化與維持。另外，不同性別的瘦椒樹具有不同的經濟價值，如雄株長勢 較兩性株好，適用于園林綠化及醫藥有效成分的提取。兩性株可W產生種子，可W用來培育 幼苗擴大繁育。因此在實際應用中，根據目的的不同可選擇合適的性別比例進行栽培。 陽〇化]雌雄異株植物性別的鑒定常從外部形態、生理生化、染色體組型、同工酶、特異蛋 白質、分子標記等方面的差異來進行（李瑞麗，2006;董莉娜，2007)。關于雄全異株植物性 別的早期鑒定，W及運用微衛星分子標記對瘦椒樹性別鑒定，目前國內外均未見文獻報道。
【發明內容】
[0006] 針對現有技術中的缺陷和不足，本發明提供了一種用于鑒定瘦椒樹性別的引物及 其應用，解決了現有技術中不易早期鑒定瘦椒樹性別的技術問題。
[0007] 為解決上述問題，本發明采取的技術方案為： 陽00引用于鑒定瘦椒樹性別的引物，所述的引物對為TSMHF和TSMHR燈S為瘦椒樹拉下名Tapiscia sinensis的首字母縮寫，M和H分別為雄性Male、兩性Hermap虹odite的首字母， F為正向引物化rward首字母，R為反向引物Reverse首字母），具體序列為：
[0011] 所述的用于鑒別瘦椒樹性別的引物用于鑒別瘦椒樹的雄性及兩性性別的應用。
[0012] 具體的，采用PCR擴增方法和聚丙締酷胺凝膠電泳檢測方法利用引物TSMHF和引 物TSMHR進行瘦椒樹的雄性及兩性性別的鑒別。 陽01引更具體的，所述的PCR擴增方法中的PCR擴增體系包括：PCR混合液7. 5yLTSMHF0. 5yUTSMFR0. 5yUDNA模版20ng及&0 6. 0yLDNA模版為瘦椒樹樹葉的基因組DNA。
[0014] 再具體的，所述的聚丙締酷胺凝膠電泳檢測方法的電泳條件為電壓300V、電流 IOOmA及時間2.化。
[0015] 進一步的，在所述的聚丙締酷胺凝膠電泳檢測方法后進行銀染及顯影，所述的銀 染的染色液為質量百分比為0. 2%硝酸銀溶液，染色時間為15min;所述的顯影的顯影液包 括質量百分比為0. 04%的碳酸鋼、質量百分比為1. 2%的氨氧化鋼和體積百分比為0. 4% 的甲醒混合溶液，顯影時間為lOmin。
[0016] 本發明的有益效果：
[0017] (1)本發明對瘦椒樹的轉錄組序列進行測序，并運用微衛星分子標記與生物性狀 相關的原理，對設計的150對瘦椒樹微衛星分子標記引物進行性別鑒定方面的篩選，得到1 對可W用于鑒定不同瘦椒樹性別的引物TSMHF和TSMHR，帶型清晰、重復性好，能100%鑒 另IJ，可靠性強，可作為瘦椒樹鑒定性別的引物；
[0018] (2)本方法篩選的瘦椒樹性別鑒定的引物特異性極高，穩定性極強的微衛星標記 引物，只需要常規PCR、聚丙締酷胺凝膠電泳、染色顯影步驟，不需要進行片段分離，裸眼觀 察即可完成對瘦椒樹性別的快速鑒定，為瘦椒樹的定向育種提供理論和技術上的指導。
【附圖說明】
[0019] 圖1為引物TSMHF和TSMHR擴增的10個瘦椒樹個體的微衛星圖譜；1-5為兩性瘦 椒樹，6-10為雄性瘦椒樹，M為核巧酸片段長度標尺；
[0020] 圖2為引物TSMHF和TSMHR擴增的28個瘦椒樹個體的微衛星圖譜；1-15為兩性 瘦椒樹，16-28為雄性瘦椒樹，M為核巧酸片段長度標尺；
[0021] W下結合說明書附圖和【具體實施方式】對本發明做具體說明。
【具體實施方式】
[0022] 現有的雌雄異株植物性別的鑒定常從外部形態、生理生化、染色體組型、同工酶、 特異蛋白質、分子標記等方面的差異來進行。在本發明之前，未見到有關雄全異植物能夠通 過特定的引物進行性別鑒別的報道，不確定雄全異株瘦椒樹能否通過設計特定的引物來進 行性別的鑒定。
[0023] 本發明對瘦椒樹的轉錄組序列進行測序，并運用微衛星分子標記與生物性狀相 關的原理，對自主開發的（見表1)150對瘦椒樹微衛星分子標記引物進行性別鑒定方面 的篩選，得到1對可W用于鑒定不同瘦椒樹性別的引物TSMHF和TSMHR，TS為瘦椒樹拉 下名Tapisciasinensis的首字母縮寫，用于表示瘦椒樹；M和H分別為雄性Male、兩性 化rmaphrodite的首字母，用于表示瘦椒樹為雄全異植物；F表示正向引物，R表示反向引 物；運是首個可W對雄全異株植物瘦椒樹進行性別鑒定的引物，通過PCR擴增的方法就能 簡便的進行瘦椒樹的性別鑒定，操作簡單、可靠性強。
[0024] 本發明所使用的瘦椒樹個體的樹葉采自陜西省西安市西北大學太白校區和陜西 省安康市寧陜縣旬陽巧鎮的秦嶺南坡。 陽0巧]本研究使用的SSR引物來自瘦椒樹轉錄測序獲得的化igenes(非冗余基因序列）， 數據已提交NCBI(Hie化tionalCenterforBiotechnologyInformation)數據庫，網址： ht1:p://www.ncbi.nlm.nih.gov/，檢索號：PRJNA284864。 W26] 實施例一：
[0027] 本研究使用的SSR引物來自瘦椒樹轉錄測序獲得的化igenes，選取其中包含有微 衛星分子標記的化igenes序列并設計引物。使用primer3軟件進行引物設計，具體參數為： (1)6(：含量范圍在40%-60%，（2)引物長度在18-276口之間，（3)退火溫度為55-63°(：，（4) 擴增長度為l〇〇-280bp。
[002引 150個包含的