一種表兒茶素單體的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于兒茶素的制備領域，具體涉及一種表兒茶素單體的制備方法。
【背景技術】
[0002]兒茶素是茶葉中最重要的生理活性物質，約占多酚類80%，屬黃烷醇類，其基本結構是α -苯基苯并吡喃，分為酯型和非酯型兩類，結構上的主要區別在于氫基取代的數量和位置不同。兒茶素主要由表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)和表兒茶素(EC)單體組成。兒茶素具有明顯的抗衰老、防癌抗突變、降脂減肥、降低血糖、血脂和膽固醇、預防心血管疾病等藥理功能，已廣泛應用于食品加工、醫藥保健和日用化工等領域。衛生部已批準了茶多酚為我國食品添加劑。國內外研究成果表明，EC可防心血管疾病，預防癌癥，抗氧化作用，具有明顯的抗衰老功能，有望開發成為一種天然的護膚品。從1990開始，由于有關茶多酚/兒茶素的保健與藥理功能研究的突破，不僅擴大了綠茶在國際市場上的份額，而且極大地推進了我國茶葉深加工產業的快速發展，為茶葉功能成分的研究與開發奠定了良好的產業與市場基礎，目前，我國已經形成年產5000多噸茶多酚/兒茶素的產業規模。兒茶素粗品傳統的提取分離工藝主要包括離子沉淀法、有機溶劑萃取法和吸附柱色譜法。由于茶葉的功能成分復雜，從茶葉中制取高純度的表兒茶素單體具有相當難度。迄今，國內外尚未有表兒茶素(EC)單體制備方面的報道。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是提供一種表兒茶素單體的制備方法，該方法簡便，只使用酒精溶劑，制備周期短，成本低，符合綠色和安全的要求，表兒茶素單體的提取率及產品純度高，適宜規模化生產。
[0004]本發明提供的技術方案是:一種表兒茶素單體的制備方法，包括如下步驟:
(1)加入純水溶解大葉綠茶兒茶素提取物，配置成濃度為5%w/v的溶液，加入檸檬酸調節pH為4.0?5.0，制得茶湯料液，備用；
(2)按照0.025%w/v的比例，在茶湯料液中添加單寧酶，在30°C?35°C下靜止酶解，間歇攪拌，得酶解液，離心過濾；
(3)將步驟(2)中過濾后的上清液通過裝有吸附樹脂的層析柱，并用乙醇水溶液進行分級洗脫，收集洗脫液，將所述洗脫液濃縮至16?18波美度，得濃縮液；
(4)將所述濃縮液在O?4°C溫度下放置48?72h，按照濃縮液總質量0.1?0.2%的比例添加少量表兒茶素單體，對濃縮液進行結晶和重結晶，離心、干燥，得到表兒茶素單體。
[0005]對上述技術方案的進一步說明:步驟(2)中，加入單寧酶酶解，可以將表兒茶素沒食子酸酯(ECG)水解成為表兒茶素和沒食子酸，從而提高粗品中表兒茶素的含量，為后續樹脂分離工藝提供較高含量底物，同時減少分離過程中表兒茶素沒食子酸酯(ECG)的影響。
[0006]對上述技術方案的進一步限定:步驟(2)中，靜置酶解時間為4-6小時，每間歇30分鐘攪拌5分鐘，在1000 r/min的轉速下離心過濾。
[0007]對上述技術方案的進一步限定:步驟(3)中吸附樹脂層析柱中的吸附樹脂用量:50倍大葉綠茶兒茶素提取物重量；上柱流速:1.0 BV/h ;解吸溶劑:10%、30%和80%乙醇水溶液；三種不同濃度的乙醇水溶液的用量均為2BV ;解吸流速:1.0 BV/h，收集30%乙醇洗脫液。
[0008]對上述技術方案的再進一步限定:所述吸附樹脂為ADS-8、HPD-450和HPD-450A之
O
[0009]本發明所述的一種制備表兒茶素(EC)單體的方法，采用由單寧酶直接對表兒茶素沒食子酸酯(ECG)進行酶解，使得表兒茶素沒食子酸酯(ECG)水解為表兒茶素(EC)，成功解決了表兒茶素(EC)與酯型兒茶素(ECG和EGCG)難以分離的技術難題；同時，采用優選的吸附樹脂ADS-8、HPD-450和HPD-450A可以有效分離表兒茶素(EC)與表兒茶素沒食子酸酯(ECG)，對酯型兒茶素的水解產物沒食子酸和其它雜質吸附率低，解決了表兒茶素(EC)與其它雜質的分離，從而成功實現了表兒茶素(EC)單體的制備。
[0010]本發明具有的有益效果:本發明方法以大葉綠茶兒茶素提取物為原料，聯用酶工程技術，經過單寧酶酶解，吸附樹脂柱色譜與結晶、重結晶技術，從綠茶提取物中分離純化表兒茶素(EC純度>98%)單體，優化了產品分離純化工藝流程，單體提取率及產品純度高。產品可防心血管疾病，預防癌癥，抗氧化作用，具有明顯的抗衰老功能，有望開發成為一種天然的護膚品。也是許多功能食品開發的重要原料，可單獨或者與維生素類、天然植物成分復配應用于保健食品、化妝品等領域。本發明方法簡便，制備周期短，成本低，符合環保和安全的要求，適宜規模化生產。
【具體實施方式】
[0011]實施例1
1、取大葉綠茶兒茶素提取物100克，配成2000ml兒茶素溶液，加入檸檬酸調節pH為4.0?5.0，向所述溶液中添加0.5克單寧酶，在30?35°C下酶解4小時，每間歇30分鐘攪拌5分鐘，將酶解液在1000 r/min條件下離心過濾；
2、將步驟I中過濾后的上清液緩慢通過裝有ADS-8吸附樹脂的層析柱，并分別用10%、30%,80%的乙醇水溶液依次洗脫，吸附樹脂用量:50倍大葉綠茶兒茶素提取物重量；上柱流速:1.0 BV/h ;三種不同濃度的乙醇水溶液的用量均為2BV ;解吸流速:1.0 BV/h ;收集30%的乙醇洗脫液，并將所述洗脫液濃縮至16?18波美度，得濃縮液；
3、將所述濃縮液在O?4°C溫度下放置48?72小時，按照濃縮液總質量0.1%的比例添加少量表兒茶素(EC)單體對濃縮液進行結晶和重結晶，然后離心、干燥得到10.25g白色固體。將步驟3得到的白色固體與表兒茶素(EC)標準品(購自美國Sigma-Aldrich公司，C15H14O6, M.W.290.27，編號:E4018，純度彡98% (HPLC))對照鑒定并經高效液相色譜法分析檢測(鑒定、檢測結果為:所述白色固體，分子量為290，(-)ES1-MS m/z:289 [Μ —H]-，熔點240°C，分子式為=C15H14O6，表明所述白色固體為表兒茶素(EC)單體，而且純度彡98%。
[0012]實施例2