一種選擇性分離苯丙氨酸生物轉化液中肉桂酸及循環利用轉化液的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物分離技術領域，設及一種在生物轉化制備肉桂酸過程中將產物分 離并將轉化液重復利用的方法。
【背景技術】
[0002] 肉桂酸，又名0-苯丙締酸、3-苯基-2-丙締酸。是從肉桂皮或安息香分離出的有 機酸。植物中由苯丙氨酸脫氨降解產生的苯丙締酸。
[0003] 肉桂酸的主要用途：a、在香精香料中的應用：肉桂酸本身就是一種香料，具有很 好的保香作用，通常作為配香原料，可使主香料的香氣更加清香揮發，可作為蘋果香精、樓 桃香精、水果香精、花香香精調和使用；可作為芳香混合物用于香皂、香波、洗衣粉、日用化 妝品中；b、在醫藥中的作用：肉桂酸可用于合成氯苯氨下酸和肉桂苯贓嗦，前者為脊椎骨 骸松弛劑和鎮定劑，后者用于腦血栓，腦動脈硬化，冠狀動脈硬化等病；還可用于合成治療 冠屯、病的重要藥物乳酸可屯、定和屯、痛平；C、在食品添加劑的應用：可用飲料、冷飲、糖果、 酒類等食品。利用肉桂酸的防霉防腐殺菌可應用于糧食、蔬菜、水果中的保鮮、防腐。肉桂 酸還可用在葡萄酒中，使其色澤光鮮。t在日化中的作用：酪氨酸酶是黑色素合成關鍵酶， 它啟動了由酪氨酸轉化為黑色素生物聚合體的級鏈反應。肉桂酸有抑制形成黑色酪氨酸酶 的作用，對紫外線有一定的隔絕作用，能使褐斑變淺，甚至消失，是高級防曬霜中必不可少 的成份之一。
[0004] 肉桂酸生產方法：肉桂酸可W通過化學工藝合成和生物法制備，工業化制備肉桂 酸主要為化學法：（1)化rkin合成法、（2)苯甲醒-丙酬法、（3)苯甲醒-醋酸法、（4)苯乙 締-一氧化碳法、（5)苯乙締-二氧化碳法、（6)苯乙締-四氯化碳法、（7)肉桂醒氧化法等。 主流工藝化rkin即W苯甲醒和醋酢為原料，在弱堿的作用下醒作為受體，乙酸酢的a-H被 奪去后W負離子的形式作為給予體，進行親核加成，最后生成肉桂酸。化學合成方法需要大 量有機溶劑，污染環境，不利于工業化，并且運些方法或流程長，溫度高，能耗大，收率低；或 副產物多，分離純化難，污染嚴重，合成出的肉桂酸可能達不到安全可食用級別，而生物法 制備的肉桂酸完全可W解決運些問題。生物法制備肉桂酸W生物制備的k苯丙氨酸為底 物，利用苯丙氨酸解氨酶催化k苯丙氨酸非氧化脫氨基生成肉桂酸和氨。利用生物催化法 合成肉桂酸可W在體外實現的肉桂酸的全生物合成，得到的肉桂酸由于其產品天然、無毒、 過程可控，成為當下肉桂酸高端產品開發應用的迫切需求，具有極大的市場空間和社會效 益。目前生物法制備研究還不是很多，其中一個因素就是肉桂酸對苯丙氨酸解氨酶具有明 顯的抑制作用，生物轉化率較低導致反應結束轉化液中含有較高濃度的苯丙氨酸和較低濃 度的肉桂酸，尋求一種從苯丙氨酸溶液中快速有效分離肉桂酸的方法不僅有利于解除反應 中的產物抑制現象，對于生物制備肉桂酸的工業化實現同樣具有重要意義。
【發明內容】
陽〇化]本發明的目的在于提供一種可W從全細胞催化制備肉桂酸的轉化液中通過快速 簡便的方法把底物和產物分離，并可將轉化液和細胞重復利用的方法。
[0006] 本發明技術方案的理論基礎：
[0007] 全細胞生物催化制備肉桂酸的基本方法是利用含有苯丙氨酸解氨酶活性的菌體 在堿性條件下Wk苯丙氨酸為底物，通過非氧化脫氨生成肉桂酸，并釋放出氨。
[0009] 其生物轉化液中主要富含有苯丙氨酸、肉桂酸和少量氨。因此，肉桂酸的快速分離 過程主要也就是肉桂酸與苯丙氨酸的分離過程。
[0010] 苯丙氨酸和肉桂酸在堿性反應條件下具有較好的溶解性，但由于肉桂酸屬于弱酸 難溶性物質，在弱酸性條件下會選擇性析出，通過調節抑和簡單的固液分離解除肉桂酸產 物抑制，一方面直接獲得純品肉桂酸，另一方面轉化液中殘余的苯丙氨酸由于解除了產物 抑制了繼續被生物轉化，從而提高了底物利用率和反應轉化率。
[0011] 本發明的目的是通過下列技術措施實現的：
[0012] 一種選擇性分離苯丙氨酸生物轉化液中肉桂酸及循環利用轉化液的方法，它包括 W下步驟：
[0013] (1)苯丙氨酸生物轉化液經固液分離分別得到清液I與細胞菌體；
[0014] (2)將步驟（1)得到的清液I用酸調節抑值至4. 5,在室溫下攬拌處理至白色沉 淀析出；
[001引 做步驟似得到的混合體系經固液分離得到清液II與沉淀，沉淀經洗涂、冷凍干 燥得到肉桂酸樣品；
[0016] (4)步驟（3)得到的清液II用堿調節抑值至生物轉化所需抑，再與步驟（1)得 到的細胞菌體混合，繼續進行生物轉化制備肉桂酸。
[0017] 步驟（1)中，所述的苯丙氨酸生物轉化液含有5~40g/L底物苯丙氨酸、10~ 20g/L產物肉桂酸W及苯丙氨酸解氨酶活性的細胞菌體，苯丙氨酸生物轉化液pH為9. 0， 所述的含有苯丙氨酸解氨酶活性的細胞菌體為含有植物來源苯丙氨酸解氨酶的重組大 腸桿菌或重組酵母細胞口angY. ,JiangT. ,CongY. ,ZhengZJ. ,OuyangJ*.Molecular CharacterizationofaRecombinantZeamaysPhenylalanineAmmonia-Lyase(ZmPAL2) andItsApplicationintrans-CinnamicAcidProductionfromL-Phenylalanine.Appl BiochemBiotechnol. , 2015, 176:924 - 937. ]〇
[0018] 步驟（2)或（3)中，所述的固液分離方式為過濾或離屯、。
[0019] 步驟（2)中，所述的酸為鹽酸或硫酸。
[0020] 步驟似中，攬拌轉速100~200巧m。
[0021] 步驟（3)中，所述的洗涂為使用蒸饋水洗涂2~3次。 陽02引步驟（4)中，所述的堿為氨氧化鋼或氨氧化鐘。 陽02引步驟（4)中，生物轉化所需抑為9. 0。
[0024] 步驟（4)中，清液II用堿調節抑值至生物轉化所需抑，再與細胞菌體混合，添加 或不添加苯丙氨酸，利用原有細胞菌體循環進行多次催化制備肉桂酸。
[00巧]有益效果：本發明方法解決了現有的生物制備肉桂酸中產物抑制嚴重，肉桂酸產 量低和產品純度不高的問題。本發明采用轉化液適度酸化選擇性沉淀分離肉桂酸方法得 到的肉桂酸產品，降低底物抑制作用并使轉化液和細胞可循環利用的方法，產率最高可達 95%，產品純度可達98%W上。該方法不僅過程簡易，可大大降低提取成本，還可實現得靜 息細胞和轉化液多次循環利用。
【附圖說明】
[0026] 圖1為肉桂酸標準樣品和實驗樣品紅外色譜圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合實驗室具體的實驗數據進一步闡述本發明。運些實施例僅用于說明本發 明而不用于限制本發明的范圍。 陽02引實施例1:
[0029] 1、稱取0. 6g苯丙氨酸，放入50ml錐形瓶中，加入30ml的Tris緩沖液，鹽酸 調整抑至9.0,并分別加入0. 26g含苯丙氨酸解氨酶的重組大腸桿菌【參考文獻：Zang Y.,JiangT. ,CongY.,ZhengZJ.,OuyangJ*.MolecularCharacterizationofa RecombinantZeamaysPhenylalanineAmmonia-Lyase(ZmPAL2)andItsApplication intrans-CinnamicAcidProductionfro