一種原代成纖維細胞siRNA的轉染方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞轉染領域，特別是涉及一種原代成纖維細胞SiRNA的轉染方法。
【背景技術】
[0002]siRNA是一種小RNA分子(21-25 bp)，它是siRISC中的主要成員，可激發與之互補的目標mRNA的沉默，從而調節靶基因的表達、影響細胞的生物功能。由于其功能的獨特性，借助基因轉染，siRNA已被廣泛應用于研究特定基因對器官生長、發育和分化的影響，也被作為一種基因藥物試用于預防和治療多種疾病如病毒感染、腫瘤、遺傳性和代謝性疾病以及神經系統疾病。基因轉染方法的選擇和這些方法轉染效率的高低，直接影響了 siRNA在這些領域的應用和發展。
[0003]基因轉染是將具有生物功能的核酸轉移或運送到細胞內并使核酸在細胞內維持其生物功能的過程。根據轉染機制和基因運載系統的不同，基因轉染可分為物理性、化學性和病毒性三種，其中脂質體和脂質體復合物轉染是最常用的化學轉染。與其它基因一樣，siRNA轉染入細胞也需要借助于病毒載體或脂質體載體。這些載體雖然作用機理不同，對細胞的毒副作用有輕有重，但大都可以有效地將基因轉入已成細胞系的細胞，并已在細胞系細胞的功能和生物性狀的研究中發揮過重要作用。然而研究中發現，細胞系細胞往往失去了部分源組織細胞的生物性狀，它的研究結果并不能完全反應源組織細胞在體內的生物過程，因此越來越多的研究直接使用原代培養的細胞，即原代細胞。病毒載體對原代細胞的轉染效率較高，但操作過程復雜、存在著可整合改變宿主細胞基因的隱患。脂質體復合物載體操作簡單，不直接影響宿主基因，但對原代細胞的轉染效率不高，因此，完善轉染方法，提高轉染效率，將使脂質體復合物轉染成為簡單、安全并高效的體外原代細胞的轉染方法，也將更有利于研究各種目的基因對細胞生物功能的影響。
[0004]成纖維細胞是結締組織的主要細胞成分，由胚胎時期的間充質細胞分化而來，在組織損傷和修復中發揮重要作用。最新研究表明，成纖維細胞還可通過自身增殖和分泌功能的調節而推動腫瘤的發展。因此，建立有效的原代成纖維細胞siRNA轉染方法將不僅有利于成纖維細胞基因調控的研究，也將有利于開發出一些藥物靶點來調節成纖維細胞的活性從而最終達到控制炎癥和腫瘤發展的目的。
[0005]常用的脂質體或脂質體復合物轉染試劑有Invitrogen公司的Lipofectamine、Qiagen 公司的 Hiferfect、Thermo Fisher Scientific 的 Darmafect。LipofectamineRNAiMAX是一種陽離子脂質體試劑，其說明書中雖然說明僅用InM siRNA即可獲得較好的靶基因干擾效果，但在實際實驗中發現，當用于原代成纖維細胞siRNA轉染時，轉染效率并不高，而提高siRNA濃度和轉染試劑的含量，其毒副作用也隨之提高。Darmafect也存在著類似的問題。
[0006]Hiperfect轉染試劑是一種陽離子和中性脂類的復合物，能實現高效的siRNA吸收和細胞內siRNA的高效釋放，而且在使用高濃度siRNA時，細胞毒副作用低。但在觀察轉染效率時卻發現，按照常規的貼壁細胞轉染方法或說明書中推薦的方法進行轉染，此轉染試劑的轉染效率依然很低。
【發明內容】
[0007]本發明主要解決的技術問題是提供一種原代成纖維細胞siRNA的轉染方法，改進現存在的轉染方法，提高siRNA在原代成纖維細胞中的轉染效率。
[0008]為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是:提供一種原代成纖維細胞siRNA的轉染方法，包括步驟為:將成纖維細胞接種于孔板上，在接種后的一定時間內加入siRNA和轉染試劑的混合物溶液進行轉染，所述一定時間為30-180 min。
[0009]在本發明一個較佳實施例中，所述一定時間為30 min-60 min。
[0010]在本發明一個較佳實施例中，轉染時所述成纖維細胞的接種濃度為2-6 X 14至24孔板或1.5-2.0X 15至6孔板。
[0011]在本發明一個較佳實施例中，轉染時所述成纖維細胞的接種濃度為4 X 14至24孔板或1.5 X 15至6孔板。
[0012]在本發明一個較佳實施例中，所述siRNA在與所述轉染試劑混合后的濃度為50-200 nMo
[0013]在本發明一個較佳實施例中，所述siRNA在與所述轉染試劑混合后的濃度為100
nMo
[0014]在本發明一個較佳實施例中，所述siRNA和轉染試劑的混合物是siRNA與轉染試劑按體積比為1:1_1:3進行混合的。
[0015]在本發明一個較佳實施例中，所述siRNA和轉染試劑的混合物是siRNA與轉染試劑按體積比為1:1進行混合的。
[0016]本發明的有益效果是:本發明的原代成纖維細胞siRNA的轉染方法，采用此轉染方法對原代成纖維細胞進行轉染，轉染效率明顯增加，轉染效果穩定，重復性好，避免了按照常規轉染方法或按照Hiperfect說明書進行實驗時所出現的問題。
【附圖說明】
[0017]為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其它的附圖，其中:
圖1是本發明中成纖維細胞傳代后不同時間時加入轉染試劑和siRNA，目的基因被其siRNA knock down的程度，圖中所示是代表性目的基因透明質酸合成酶2基因的siRNA對其表達的抑制程度。
[0018]圖2是本發明中加入轉染試劑后成纖維細胞的密度，A為轉染后24 h鏡下觀察結果，B為轉染后48 h鏡下觀察結果，C為轉染后72 h鏡下觀察結果，本實驗重復了 3次，圖中所示是一代表性實驗結果，放大倍數100X。
[0019]圖3是本發明中不同濃度的siRNA對目的基因knock down的效果，圖中所示是不同濃度代表性目的基因HAS2 siRNA對HAS2基因表達的影響。
[0020]圖4是本發明中不同濃度的siRNA對目的基因knock down的效果，圖中所示是不同濃度代表性目的基因HAS2 siRNA knock down HAS2基因后，成纖維細胞合成HA能力的變化。
[0021]圖5是本發明中采用的細胞接種數、接種時間和siRNA濃度(如文中所述)，在轉染后24 h、48 h和72 h時對目的基因knock down的效果，圖中所示是代表性目的基因HAS2siRNA 的 knock down 效果。
[0022]圖6是本發明中采用的細胞接種數、接種時間和siRNA濃度(如文中所述)，在轉