一種木爾坦棉花曲葉病毒侵染紅麻的接種方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物保護領域，特別涉及一種木爾坦棉花曲葉病毒侵染紅麻的接種方法。
【背景技術】
[0002]木爾坦棉花曲葉病毒(Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMuV)最先被發現于巴基斯坦木爾坦地區棉花上一種植物病毒，是引起巴基斯坦棉花曲葉病大流行的主要病原病毒之一。該病毒屬雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)；由煙粉虱以持久方式傳播，但不能通過機械摩擦接種和種子帶毒傳播。該病毒基因組僅含A組分(DNA-A)，為單鏈環狀，是一種單組分雙生病毒。目前已報道的CLCuMuV各分離物普遍伴有β衛星分子(先前稱之為DNA β)0 CLCuMuV主要分布于巴基斯坦、印度、菲律賓、老撾、越南及我國的廣東、廣西、海南、云南、福建、江蘇等地，已報道的自然寄主包括棉花、朱槿、垂花懸鈴花、黃秋葵、紅麻等5種植物。
[0003]建立植物病毒人工接種方法，將其接種到相關寄主植物上，是研究病毒的致病性和為害性的前提和基礎。關于CLCuMuV人工接種寄主植物的方法，目前已報道的方法有三種。Briddon等于2001年通過基因槍轟擊接種方法將CLCuMuV接種棉花，并引起曲葉病(Briddon等，Virology, 2001, 285(2):234-243)。林林等于2011年通過煙粉虱傳毒接種方法將CLCuMuV接種棉花、紅麻、朱槿、西菲葵、黃蜀葵等5種植物，并引起它們發病(林林等，植物保護，2011，37(4):44-47)。湯亞飛和何自福等于2015年通過農桿菌介導的侵染性克隆注射接種方法將CLCuMuV接種棉花，并引起曲葉病(湯亞飛等，中國農業科學，2015)。截止目前，還沒有關于通過農桿菌介導的侵染性克隆注射接種方法將CLCuMuV接種紅麻的報道。
[0004]煙粉虱傳毒接種方法，是利用煙粉虱在毒源植株上獲毒(CLCuMuV)飼育一定時間，然后傳毒接種到待健康植株上。該方法不足之處在于需要分離、純化、飼養和保持煙粉虱種群，要求專業性強，且耗時，接種成功與否還受季節等環境因子影響明顯，同時煙粉虱可能將毒源上包括CLCuMuV在內的各種病毒等微生物無區別地全部傳播到接種植株上。基因槍轟擊接種方法，是利用專業設備基因槍將包裹了帶有CLCuMuV的高速微彈直接送入完整的植物組織細胞中。該方法不足在于需要購買價格昂貴的專業儀器基因槍，且需要專業人才操作，運行成本昂貴，難以適用于大量樣本的操作。侵染性克隆注射接種方法，是將CLCuMuV的基因組克隆到植物表達載體上，并導入農桿菌中，通過人工注射接種到植物組織中，實現對植物的侵染。該方法操作簡便、成本低、重復性好、結果準確等優點，但需要針對不同寄主植物研制不同的接種方法。
【發明內容】
[0005]本發明的首要目的在于提供一種木爾坦棉花曲葉病毒侵染紅麻的接種方法，該方法操作具有簡便、成本低、重復性好、結果準確等優點。
[0006]本發明的另一個目的在于提供上述木爾坦棉花曲葉病毒侵染紅麻的接種方法的應用。
[0007]本發明的目的通過下述技術方案實現:
[0008]—種木爾坦棉花曲葉病毒侵染紅麻的接種方法，包括如下步驟:
[0009](I)侵染性克隆的構建
[0010]將木爾坦棉花曲葉病毒(Cottonleaf curl Multan virus，CLCuMuV) 1.3 ?2.0個拷貝的正向重復全長基因組(DNA-A)和2個拷貝的正向重復β衛星分子φΝΑβ)分別構建到植物表達載體上，得到含有1.3?2.0個拷貝的正向重復全長基因組的侵染性克隆I和含有2個拷貝的正向重復β衛星分子的侵染性克隆II ;
[0011](2)接種菌液的準備
[0012]將步驟⑴構建的侵染性克隆I和II分別導入到農桿菌中，獲得含有侵染性克隆I的農桿菌和含有侵染性克隆II的農桿菌；分別培養并收集含有侵染性克隆I和II的農桿菌菌體，用接種緩沖液重懸菌體并靜置2?3h，得到用于接種紅麻的接種菌液I和II ;
[0013]⑶接種處理
[0014]將步驟⑵制得的接種菌液I和II按1:1體積比混合，得到混合菌液，將混合菌液分6?8點注射接種4?5葉期的紅麻植株的葉肉組織和莖干維管束組織中，然后將接種后的紅麻植株繼續培養；
[0015]步驟(I)中所述的植物表達載體優選為pBinPLUS或pGreen II 049 ；
[0016]步驟(I)中所述的侵染性克隆I優選為pBinPLUS-Ι.85A或pGreen II 049-1.6A ；
[0017]步驟(I)中所述的侵染性克隆I進一步優選為pBinPLUS-Ι.85A ；
[0018]步驟(I)中所述的侵染性克隆II優選為和pBinPLUS-2.0 β或pGreen II 049-2.0 β ；
[0019]步驟(I)中所述的侵染性克隆II進一步優選為和pBinPLUS_2.0f3 ；
[0020]步驟(2)中所述的農桿菌優選為EHA105或GV3101 ；
[0021]步驟(2)中所述的含有侵染性克隆I和II的農桿菌菌體優選通過如下方法獲得:分別活化含有侵染性克隆I和II的農桿菌菌種，然后挑取單菌落接種于液體培養基中，28°C、180?220rpm振蕩培養20?24小時，獲得種子液；取種子液接種于液體培養基中，280C、180?220rpm振蕩培養20?24小時，收集菌液，離心，棄上清，分別獲得含有侵染性克隆I和II的農桿菌菌體；
[0022]步驟⑵中所述的接種緩沖液優選包含如下組分=1mmol.L 1MgCl2,1mmol.L 1MES,500 μ mol.L 1AS ；
[0023]步驟⑵中所述的接種菌液I和II的OD6。。值優選為0.9?1.1 ;
[0024]步驟(3)中所述的混合菌液的用量優選為0.6?ImL ；
[0025]步驟(3)中所述的紅麻植株優選通過如下方法獲得:將播種后的紅麻種子置于26°C?28°C、16h光照/8h黑暗條件下培養，待紅麻植株長至4?5葉期時用于接種；
[0026]步驟(3)中所述的紅麻植株繼續培養的條件優選為26°C?28°C、16h光照/8h黑暗;
[0027]步驟(3)中所述的紅麻植株繼續培養的時間優選為30?60天；
[0028]本發明相對于現有技術具有的優點及效果:
[0029]截止目前，國內外僅林林等(2010)報道通過煙粉虱傳毒接種紅麻的方法，至今還未見有利用農桿菌介導的侵染性克隆人工注射接種方法接種紅麻的報道。主要原因有兩方面:一是構建的CLCuMuV侵染性克隆對紅麻不具有侵染能力；二是人工接種紅麻的生育期選擇不正確；三是人工接種紅麻的接種部位選擇不正確。
[0030]本發明正是突破上述這三個技術瓶頸，構建了對紅麻具有侵染性的CLCuMuV及其β 衛星分子的侵染性克隆 pBinPLUS-1.85A 或 pGreen II 049-1.6A 及 pBinPLUS-2.0 β 或pGreen II 049-2.0 β ;通過人工注射接種方法，將侵染性克隆接種到4?5葉期的紅麻，實現CLCuMuV對紅麻的侵染，接種效率達到30% (比Briddon等用基因槍法接種棉花的效率高一倍以上)。與現有技術相比，該方法不需昂貴的儀器、操作簡單、重復性好、效率較高，且不會出現其他病毒等交叉污染，適合于大規模樣品的處理。
【附圖說明】
[0031]圖1是利用農桿菌介導的侵染性克隆接種法接種紅麻的癥狀表現結果分析圖；其中，A:pBinPLUS-l.85A 和 pBinPLUS-2.0 β 混合接種(60d) ；B:pBinPLUS-l.85A 和pBinPLUS-2.0 β 混合接種(3Od) ;C:pBinPLUS_l.85Α 單獨接種(3Od) ；D:pBinPLUS-2.0 β單獨接種(30d) ;E:健康紅麻植株(對照)。
【具體實施方式】
[0032]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0033]實施例1
[0034]CLCuMuV及β衛星分子侵染性克隆的構建
[0035]CLCuMuV的侵染性克隆pBinPLUS-Ι.85A、pBinPLUS-2.0 β (侵染廣東黃秋葵的雙生病毒分子特征及其侵染性克隆構建，碩士論文，甘肅農業大學，2010)由廣東省農業科學院植物保護研究所蔬菜病害研究室構建。
[0036]以木爾坦棉花曲葉病毒廣東分離物基因組DNA(GenBank:FJ770370)為模板，用引物 OPAL:5’ -GGTACCTCCCAGATATATGCGCCAT-3’(引入 Kpn I 位點)和 OPAR:5’ -GGTACCAAATCCCCTTTATTTCAAG-3’(含Kpn I位點)進行PCR擴增，獲得I倍全長DNA-A，測序驗證無誤后，選取序列本身帶有的Sal I酶切位點和引入Kpn I酶切，獲得0.85A，插入經同樣酶切的植物表達載體pBinPLUS，得到克隆pBinPLUS-Ο.85A。然后用Kpn I酶切全長1.0A，插入經同樣酶切的pBinPLUS-Ο.85A，通過酶切篩選正向重復，獲得含有1.85個拷貝的正向重復全長基因組的侵染性克隆pBinPLUS-Ι.85A。同樣以木爾坦棉花曲葉病毒廣東分離物基因組DNA(GenBank:FJ770371)為模板，以相鄰反向引物 β 05:5’-GAATTCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’ (引入 EcoR I 位點)和 β 02:5’-GGTACCTACCCTCCCAGG GGTACAC-3’ (引入 Kpn I 位點)進行PCR擴增，測序驗證無誤后，將該克隆經EcoR I和Kpn I酶切，插入經同樣酶切的植物表達載體pBinPLUS，得到克隆pBinPLUS-L 0β。以相鄰反向引物β 01:5’-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’ (引入 Kpn I 位點)和 β 02:5’-GGTACCTACCCTCCCAGG GGTACAC-3?(引入Kpn I位點)進行PCR擴增，測序驗證無誤后，用Kpn I酶切β 01和β 02擴增獲得的全長及pBinPLUS-Ι.0 β，通過酶切篩選正向重復，獲得含有2.0個拷貝的正向