一種超聲波輔助外源基因轉化酵母菌的方法
【專利說明】-種超聲波輔助外源基因轉化酵母菌的方法 (-)技術領域
[0001] 本發明設及外源基因導入微生物的方法，尤其設及一種將構建的含有外源基因的 質粒導入酵母菌的高效超聲波轉化方法。 (二）【背景技術】
[0002] 膽固醇氧化酶在食品開發、醫療保健、臨床檢測、生物農藥等方面具有廣泛的應用 價值。目前國內膽固醇氧化酶市場供應短缺，都從國外進口。隨著研究深入，它的市場范圍 也從最初的臨床診斷試劑擴展到食品加工、制藥工業、生物化學和生物抗蟲等領域，產品需 求量越來越大。但是野生菌株達不到工業化生產要求，故目前都集中在通過基因工程方法 來提高膽固醇氧化酶產量。而常規的基因工程方法要求有高端儀器設備，所用試劑昂貴且 大多對人體和環境有害，超聲波作為一種物理方法可W解決運種不利。
[0003] 轉化是指受體菌直接從周圍環境中吸收供體菌游離的DNA片段，并整合入受體菌 基因中，從而獲得了供體菌部分遺傳性狀的過程。通常可經過物理或者化學的方法來提高 轉化率。傳統的方法有化學促進法，載體介導法和機械法等，運些方法盡管得到廣泛應用， 也取得不菲的成果，但是都有不同程度的缺陷。有的效率低下，有的過程繁冗，有的成本昂 貴，特別是一些細胞只對某一個或某幾個方法敏感。而物理方法是基于細胞膜的破壞來提 高通透性，不依賴于細胞型，因此更具有廣泛應用價值。超聲波是一種傳統的細胞破壁技 術，被認為是一種潛在的轉化方法。 (H)
【發明內容】
[0004] 本發明提供一種超聲波輔助外源基因轉化酵母菌的方法，該方法新穎、轉化條件 溫和、成本低、綠色環境，易于實現基因轉化的方法，解決了現有方法轉化率低，細胞活力 低，易死亡等問題。 陽0化]本發明采用如下技術方案：
[0006] 本發明提供一種超聲波輔助外源基因轉化酵母菌的方法，所述方法為：將攜帶外 源基因的表達質粒與酵母菌感受態細胞懸液混合，加入二甲基亞諷構成反應液，調節反應 液抑值至5. 0~6. 0,在28~32°C、超聲波場強200~500W的條件下進行轉化反應，轉化 反應結束后，篩選獲得含外源基因的酵母菌的陽性轉化子；所述酵母菌感受態細胞懸液是 由酵母菌感受態細胞與冰預冷的Imol/L的山梨醇水溶液重懸而成。
[0007] 進一步，所述二甲基亞諷在反應液中體積終濃度為1-4%。
[0008] 進一步，所述轉化反應在28~32°C、超聲波場強200~500W的條件下反應10~ 30min〇
[0009] 進一步，所述攜帶外源基因的表達質粒中外源基因為膽固醇氧化酶基因，核巧酸 序列為沈QIDNO. 1所示。
[0010]
[0011] 進一步，所述酵母菌為畢赤酵母菌（Pichiapasto;ris)GS115,購自invitrogen公 司。
[0012] 進一步，所述攜帶外源基因的表達質粒與酵母菌感受態細胞懸液體積比為 1:40-55,所述酵母菌感受態細胞懸液中濕菌體含量為1XIO7~1X10 8個細胞/ml。
[0013] 進一步，所述酵母菌感受態細胞按如下步驟制備：將酵母菌接種至YTO液體培養 基中，28~30°C振蕩培養過夜，取培養液W體積濃度10%的接種量接種到YTO液體培養基 中，28~30°C培養至ODe。。= 1. 3~1. 5,在4°C、1500r/min條件下離屯、5-lOmin，收集濕菌 體；將濕菌體置于冰水預冷的裝有無菌水的無菌聚丙締管中，于4°C，12(K)r/min離屯、5min， 棄上清，重復操作2次（即加入無菌水重懸沉淀并離屯、，后一次無菌水體積用量為上一次的 50% )，再用冰預冷的Imol/L的山梨醇水溶液將菌體沉淀重懸，4°C，12(K)r/min離屯、5min， 棄上清，用冰預冷的Imol/L的山梨醇水溶液將菌體沉淀重懸，獲得酵母菌感受態細胞懸 液。
[0014] 進一步，所述攜帶膽固醇氧化酶基因的表達質粒為pPICZB-choB載體質粒。
[0015] 本發明所述超聲波輔助外源基因轉化酵母菌的方法，具體按如下步驟進行：
[0016] (1)酵母菌感受態細胞的培養和收集
[0017] 挑取酵母菌（優選畢赤酵母菌GSl15)單菌落，接種在5mLYro液體培養基中， 30°C振蕩培養過夜，再將培養液W體積濃度10%的接種量轉移到50mLYTO液體培養基中， 28-30°C培養到ODe。。= 1. 3~1. 5,4°C1500r/min離屯、5-lOmin，收集濕菌體；將濕菌體置 于冰水預冷含50mL無菌水的無菌聚丙締管，于4°C，12(K)r/min離屯、5min，棄上清，每管再 用50血的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸，4°C，120化/min離屯、5min，棄上清，再用25血 的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸，4°C，120化/min離屯、5min，棄上清，沉淀用2血的冰預 冷的Imol/L的山梨醇水溶液將菌體沉淀重懸，4°C，120化/min離屯、5min，棄上清，沉淀再用 200yL的冰預冷的Imol/L的山梨醇水溶液將菌體沉淀重懸，獲得酵母菌感受態細胞懸液；
[0018] (2)W酵母菌為宿主的基因轉化研究
[0019] 將酵母菌感受態細胞懸液中加入體積終濃度1-4%的二甲基亞諷構成反應液，添 加攜帶膽固醇氧化酶基因的pPICZB-choB載體質粒，在抑值至5. 0~6. 0、28~32°C、超聲 波場強200~500W下，經超聲波作用進行轉化反應，分別考察場強和處理時間等參數對轉 化的影響；
[0020] (3)陽性轉化子的篩選
[0021] 當轉化結束后，將轉化后的菌液涂布到含80~120yg/mL的zeocine的YTO平板 上進行篩選，28~30°C條件下培養3~4山得到陽性轉化子；
[0022] (4)陽性轉化子的鑒定
[0023] 隨機選取轉化平板上的轉化子提取基因組DNA，W其為模板，采用特異性引物進行 PCR驗證。所用引物：5' -TTCCATGGCCGATAGCCGGGCGAACAG-3' 和 5'-GCGAATTCTCACTGGATGT 〔664〔6464164-3'。？〇?反應條件為：941：5111111;941：303,551：303,72°(：1111111，30個循環； 72°C5min;凝膠電泳檢測重組載體是否插入畢赤酵母基因組。
[0024] 與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在：
[00巧]1)目前報道多集中在超聲誘導植物和動物基因轉化，本發明擬W超聲波方法誘導 微生物基因轉化。
[00%] 2)常用的基因轉化方法有基因工程法和電穿孔法，基因工程法要求有高端儀器設 備，所用試劑昂貴且大多對人體和環境有害；電穿孔要求有較低的離子介質和較高的電壓， 并且接合要求有直接細胞-細胞接觸。本發明所述超聲波誘導基因轉化方法更加環保，不 依賴于細胞型，且轉化率和電轉化率相當。當前電轉化是主要轉化方法，本發明超聲波促進 轉化不僅具有前述優勢，而且轉化率與報道電轉化率較高的文獻相當甚至超過，如王永興 的ECM830電穿孔儀在畢赤酵母電轉化中的應用（動物醫學進展，2006,27(增）：82-84), 轉化效率約為3Xl(f/yg DNA，本發明轉化率達3. 5Xl(f/yg DNA。 (四）
【附圖說明】
[0027] 圖1為實施例1陽性轉化子篩選凝膠電泳圖，泳道M為Marker,泳道1為陽性轉化 子。
[002引圖2為實施例2陽性轉化子篩選凝膠電泳圖，泳道M為Marker,泳道1為陽性轉化 子。
[0029] 圖3為實施例3陽性轉化子篩選凝膠電泳圖，泳道M為Marker,泳道1為陽性轉化 子。 (五）
【具體實施方式】
[0030] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此： 陽03UYPD液體培養基配方為：酵母膏lOg，蛋白腺20g，葡萄糖20g，1000 ml水。
[0032] YPD平板配方為：酵母膏lOg，蛋白腺20g，葡萄糖20g，瓊脂粉20g，1000 ml水。 陽〇3引 實施例1
[0034] (1)畢赤酵母菌感受態細胞的培養和收集
[0035] 挑取畢赤酵母菌（Pichiapasto;ris)GS115單菌落（購自invitrogen公司），接種 至5mLYTO液體培養基中，28 °C振蕩培養過夜，W體積濃度10 %接種量再轉移到50mLYPD 液體培養基中，28°C培養到ODe。。= 1. 3,將培養液在4°C、150化/min離屯、5-lOmin，收集濕菌 體。將濕菌體倒入到一個用冰水預冷的含50mL無菌水的無菌聚丙締管，于4°C，120化/min 離屯、5min，棄上清，每管再用50血的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸。4°C，120化/min離 屯、5min，棄上清，再用25血的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸，4°C，120化/min離屯、5min， 棄上清。用2mL的冰預冷的Imol/L的山梨醇水溶液將菌體沉淀重懸。4°C，120化/min離屯、 5min，棄上清，再用200yL的冰預冷的Imol/L的山梨醇水溶液將菌體沉淀重懸，得待轉化 感受態宿主細胞懸液。
[0036] (2) W畢赤酵母菌為宿主的基因轉化研究
[0037] 將膽固醇氧化酶基因ChoB克隆到pPICZB-載體質粒上。
[0038] 將含膽固醇氧化酶基因choB的pPICZB質粒（質粒濃度應不小于70ng/JiL)與步 驟（1)獲得的細胞懸液（懸液中濕菌體含量為IXlO8細胞/mU^體積比為1:40混合，即 取8yL質粒與320yL細胞懸液混合，再加入體積終濃度2 %的二甲基亞諷，置于轉化杯中， 抑調至5. 0 ;溫度調至28°C，超聲波場強為200W，處理時間為20min。
[0039] (3)陽性轉化子的篩選 W40]當轉化結束后，將轉化液離屯、，收集濕菌體，加入SOOiiL冰預冷的Imol/L的山梨 醇水溶液將轉化后的菌體混勻，轉至1. 5mL的EP管中，30°C靜置培養比。將菌體懸液涂布 于含80yg/mLzeocine的YPD平板上，每100化，200化，300yL涂布一塊平板，平板在 28°C條件下培養4