一種轉錄終止子及其在基因克隆中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及分子生物學和基因工程領域。具體的講，本發明設及一種轉錄終止子 序列及含有該轉錄終止子的克隆載體在基因克隆領域中的應用。
【背景技術】
[0002] 20世紀70年代，基因工程技術的出現，標志著人類認識和改造生命新時期的到 來，建立和發展了重組DNA技術。重組DNA技術是指在體外將含有目的基因或其它有意義 的DNA片段同能夠自我復制的載體DNA連接，然后將其轉入宿主細胞或受體生物進行表達 或進一步研究的分子操作的過程；重組DNA技術又稱分子克隆，基因操作或DNA克隆，其設 及一系列的分子生物學技術，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體 外重組、導入宿主細胞技術和重組子篩選技術等等。
[000引轉錄終止子（terminator)是給予RNA聚合酶轉錄終止信號的DNA序列。在一個 操縱單元中至少在結構基因群最后一個基因的后面有一個終止子。在真核生物中，轉錄終 止子是一種位于POly(A)位點下游，長度在數百堿基W內的結構；在原核生物中，發現終止 信號存在于RNA聚合酶已經轉錄過的序列之中。轉錄終止子可分為兩類：一類依賴蛋白輔 因子才能實現終止作用，運種蛋白質輔因子通常稱為P因子巧ho因子）；一類不依賴于蛋 白質輔因子就能實現終止作用；運類終止子在序列上有一些共通的特點，即有一段富含GC 的反向重復序列（invertedr巧eatsequence),其后跟隨一段富含AT的序列因而轉錄生成 的mRNA的序列中能形成發夾式結構，后繼一連串U，正是RNA聚合酶轉錄生成的運段mRNA 的結構阻止RNA聚合酶繼續沿DNA移動，并使聚合酶從DNA鏈上脫落下來，終止轉錄。
[0004] 化0因子負責細胞內大約20%的轉錄終止；化0因子非依賴型的轉錄終止占80% 左右。目前，人們對于第一類轉錄終止子的詳細機理研究的還不是很透徹，更多的是集中在 對第二種轉錄終止子的研究上，此種類型的轉錄終止子序列通常可W作為獨立的元件應用 于合成生物學中，可W用來終止不必要的轉錄起始。
[0005] 有關不必要的轉錄起始概念的提出，源于一些較早的毒性基因的克隆實驗。在研 究中發現，一些克隆到T7表達系統中的毒性基因不僅在宿主菌化21 0E3)中不能穩定存 在，而且在不帶有T7RNA聚合酶來源的大腸桿菌中也不能存在。運個現象可能的解釋是毒 性基因被大腸桿菌中的RNA聚合酶通讀下來了。在毒性基因啟動子的上游可能存在一些隱 秘的啟動子，他們能夠被大腸桿菌的RNA聚合酶識別并起始轉錄，產生的mRNA的量也許不 多，但產生足W對細胞產生明顯毒性的蛋白。為了解決轉錄通讀的運個問題，在毒性基因的 啟動子上游加上強有效的轉錄終止子能夠有效解決上述出現的問題。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于克服現有克隆載體的缺陷，提供一種含有人工合成轉錄終止子 的克隆載體及其制備，并將其用于大量的克隆實驗中。
[0007] 本發明的載體WPUC57載體為骨架，連入人工合成的轉錄終止子載體，采用綠色 巧光蛋白為報告基因，W能否明顯抑制巧光蛋白基因的轉錄與否來驗證轉錄終止子的效 率；同時將連有該轉錄終止子序列的PUC57載體用于克隆實驗，證實其可W作為毒性基因 或者困難基因的克隆備用載體來替代PUC57載體。
[0008] 本發明的研究圍繞一種轉錄終止子的應用展開，所述轉錄終止子編碼鏈的序列 為：
[0010] 進一步的，所述轉錄終止子兩端為平端，或者所述轉錄終止子的兩端還包括粘性 末端。
[0011] 所述粘性末端主要用于連接載體。粘性末端可根據需要克隆入載體的位置所對應 的酶切位點設計。如本發明實施例列舉的，可為對應化ndIII和PstI酶切后的粘性末端， 或為對應EcoRI和化nI酶切后的粘性末端。
[0012] 本發明第一方面提供了一種含有本發明轉錄終止子的克隆載體。
[0013] 進一步的，所述克隆載體為大腸桿菌克隆載體，所述大腸桿菌克隆載體的多克隆 位點克隆有所述轉錄終止子。
[0014] 所述克隆載體的骨架可為PU巧7,也可為其他常見的大腸桿菌克隆載體。
[0015] 如實施例列舉的，所述克隆載體WPUC57為骨架載體，轉錄終止子序列位于該載 體的多克隆位點區域中。
[0016] 具體的，所述克隆載體是將所述轉錄終止子通過EcoRI和化nI位點克隆入 PUC57載體獲得。
[0017] 本發明的克隆載體依然含有多克隆位點，能夠廣泛用于基因克隆實驗。
[0018] 本發明第二方面，提供了所述克隆載體在基因克隆領域的用途。
[0019] 進一步的，將所述克隆載體用于毒性基因或困難基因的克隆。
[0020] 所述毒性基因是指：表達后可直接或間接殺死宿主細胞的基因。
[0021] 具體的，如實施例列舉，所述毒性基因可W為毒性基因CC地。
[0022] 所述困難基因是指：在普通大腸桿菌載體中難W克隆成功的基因。所述普通大腸 桿菌載體可W為PUC57等。如本發明實施例列舉，所述困難基因可為序列為SEQIDNO. 2 的大豆花葉病毒多聚蛋白前體基因，或者編碼序列為SEQIDNO. 3的大豆花葉病毒多聚蛋 白基因。
[0023] 本發明第=方面，提供了一種毒性基因或困難基因的克隆方法，為W本發明的克 隆載體為載體，將所述毒性基因或困難基因克隆入所述克隆載體多克隆位點中的轉錄終止 子的下游。
[0024] 本發明第四方面，提供了一種載體，為在本發明的克隆載體的多克隆位點中克隆 入外源基因獲得，所述外源基因選自綠色巧光蛋白基因、編碼序列為SEQIDNO. 2的大豆花 葉病毒多聚蛋白前體基因或編碼序列為SEQIDNO. 3的大豆花葉病毒多聚蛋白基因，所述 外源基因位于本發明的轉錄終止子的下游。
[00巧]本發明第五方面，提供了一種驗證本發明轉錄終止子轉錄效果的方法，包括下列 步驟：
[0026] 1)將綠色巧光蛋白GFP的編碼基因克隆到PUC57載體的多克隆位點，并位于 pUC57載體lac啟動子的下游；
[0027] 2)將本發明的轉錄終止子及綠色巧光蛋白GFP的編碼基因均克隆入PU巧7載體的 多克隆位點，所述轉錄終止子序列插入到Iac啟動子的下游，綠色巧光蛋白起始密碼子的 上游區域；
[0028] 3)將步驟1)和2)獲得的載體分別轉化大腸桿菌感受態細胞，將經轉化的感受態 細胞分別涂布含有IPTGA-Gal的氨節青霉素平板，在自然光下或者紫外光下觀察菌落能 否呈現綠色巧光和巧光強度的變化程度，通過巧光強度的變化來反映轉錄終止子的效率。
[0029] 本發明的轉錄終止子具有有效的轉錄終止效果，將其序列克隆到載體中，構建的 載體，能夠有效的終止載體上隱秘的轉錄起始，使得該載體能夠用于毒性基因或困難基因 的克隆。因此，本發明的轉錄終止子序列能夠廣泛用于大腸桿菌克隆載體且本發明構建的 重組載體能夠廣泛用于基因克隆實驗。
【附圖說明】
[0030] 圖1粘性末端為化ndIII和PstI的酶切后序列的轉錄終止子序列TTl與pU巧7 載體連接后PCR檢測的電泳圖
[0031] 圖2插入了轉錄終止子和不含有轉錄終止子的載體對GFP蛋白轉錄水平的影響
[0032] 圖3粘性末端為EcoRI和化nI酶切后序列的轉錄終止子TT邸與PUC57載體連 接后PCR檢測的電泳圖
[0033] 圖4CC地基因穩定存在于TT邸-PUC57載體中的測序結果峰圖
[0034] 圖5困難基因EF克隆至TT邸-PUC57載體的酶切檢測圖
[0035] 圖6困難基因GH克隆至TT邸-PUC57載體的酶切檢測圖
[0036] 圖7困難基因EF和GH克隆至TT邸-pUC57載體的PCR檢測電泳圖
【具體實施方式】
[0037] 本發明采用化學合成的方式先合成引物，并通過引物中堿基的互補配對來獲得完 整的轉錄終止子序列。
[003引如實施例列舉的，含有本發明轉錄終止子的克隆載體可采用下列方法制備：
[0039] A.通過合成引物及退火獲得兩端帶有化ndIII和PstI酶切位點的轉錄終止子 序列。
[0040] B.用化ndIII和PstI酶切消化PUC57載體，將退火后的片段和載體連接后得到 含有轉錄終止子的克隆載體。
[0041] 實施例還W綠色巧光蛋白為報告基因，將轉錄終止子序列插入到Iac啟動子的下 游，綠色巧光蛋白起始密碼子的上游區域，證明其能夠有效的抑制報告基因的轉錄，使菌落 在自然光或者紫外光下呈現的綠色巧光明顯減弱。
[0042] 具體的，所述轉錄終止子效率的驗證方法可包括下列步驟：
[0043] A.通過合成引物進行PCR或全基因合成獲得編碼綠色巧光蛋白GFP的編碼鏈和互 補鏈。所述綠色巧光蛋白的基因序列如下：
[0045] B.通過產生平末端的內切酶Sma I將綠色巧光蛋白GFP的編碼基因通過平末端 連接克隆到PUC57載體中；將獲得的載體轉化大腸桿菌D冊a感受態細胞，涂布含有IPTG/ X-Gal的氨節青霉素平板，獲得的平板菌落在自然光下和紫外光下能夠觀察到明顯的綠色 巧光。
[0046] C.利用產生平末端的內切酶Sma I將綠色巧光蛋白GFP的編碼基因通過平末端連 接克隆到含有本發明轉錄終止子的PUC57克隆載體中；將獲得的載體轉化大腸桿菌D冊a 感受態細胞，涂布含有IPTG/X-Gal的氨節青霉素平板，在自然光下或者紫外光下觀察菌落 能否呈現綠色巧光和巧光強度的變化程度。通過巧光強度的變化來反映轉錄終止子的效 率。
[0047]W下列舉具體實施例進一步闡明本發明，但實例并非用于限制本發明的保護范 圍。本領域技術人員可W借鑒本文內容，對適當載體進行改造W適應特殊的用途。特別需 要指出的是，所有類似的替換或者改動都被視為包括在本發明。
[0048] 實施例中，轉化用大腸桿菌D冊a感受態細胞采用的是氯化巧法制備的；所 用限制性內切酶、連接酶等、PUC57載體及DNAmarkerSM0331均購自ThermoFisher Scientific公司。常規試劑均采用生工生物工程（上海）股份有限公司產品。擴增綠色巧 光蛋白GFP基因和CC地基因（由生工生物工程（上海）股份有限公司通過全基因合成的 方法合成）
[0049] 實施例1轉錄終止子序列的合成
[0050] 本實施例中所用轉錄終止子命名為TT1，序列如下：
[0051]TTl：
[0052]編碼鏈：（沈Q ID NO:5)
[0056] 下劃線部分是用于與酶切后的載體連接的粘性末端區域。
[0057] 設計如下引物：
[0058]TTl-Fl:(SEQID NO: 7)
[0059] 5' -AGCTTGCGGCCGCTTCTAGAGAAAAAAAAACCCCGCCCCT-3，
[0060]TT1-F2:(SEQID NO:8)
[0066] 使用化學合成法完成引物的合成，合成好的引物溶于水使其終濃度為10ymol/l， 每條引物各取2yL進行退火，按照如下體系和程序進行退火處理：
[0067] 10x1