早老素ps1基因環化基因序列及其表達方法和熒光定量檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，具體設及一種早老素PSl基因環化基因序列及其表 達方法和巧光定量檢測方法；為阿爾茨海默病疾病的早期臨床診斷提供了理想的診斷 m過rker。
【背景技術】
[0002] W往研究主要是在病毒中發現存在環狀RNA(circularRNA，circRNA)，1993年 CocquerelIe等在人體細胞中發現了circRNA，在過去的30年間由于技術水平的限制，把運 部分客觀存在的RNA忽略了，近年來，隨著深度RNA測序及規模化生物信息技術的發展，研 究者才在哺乳動物體內發現大量客觀存在的環狀circRNA，環化RNA由于形成閉合的環狀， 在生物體內非常的穩定，另外也有研究者在古細菌中發現了環狀RNA.環狀RNA由前體RNA 通過剪切，然后由線性RNA的頭對尾連接形成，環狀RNA通常是由一個W上外顯子構成的 RNA分子。
[0003] 阿爾茨海默病（Alzheimer'Sdisease,AD)是一種不可逆性神經系統變性疾病， AD有家族遺傳性和散發性兩種。家族遺傳性老年性癡呆（FamilialAlzheimerDisease, FAD)又分為早發型巧OFAD)和晚發型化OFAD)，被認為是常染色體顯性遺傳疾病。通過基 因掃描和定位克隆方法已篩選出4種與AD明確相關的致病基因，即位于21qll. 2 - 21q21 區域的APP基因、19ql3 - 13. 2區域的APOE基因、14q24. 3區域的早老素I(PSl)基因、和 lq31 - 42區的早老素PS2基因，其中PSl基因可能是EOFAD的主要責任基因。早老素基因 PSl是丫-分泌酶的核屯、組成成分，丫-分泌酶復合物是由四個膜整合蛋白組成的包含19 次跨膜螺旋的復合體，包括PSl,Aph-IJen-2和Nicastrin四個亞基，其中早老素PSl是執 行酶活功能的膜整合蛋白酶活性亞基，任何一個亞單位的表達水平降低都會導致酶復合體 形成障礙。
[0004] 對人的早老素基因PSENUpresenilin1，PS1)基因的全長RNA序列進行分析， PSl(基因登錄號NM_000021. 3)mRNA由12個外顯子組成；有文獻報道環狀RNA在生物體內 大量存在，多是由外顯子參與環化；然而，目前在運一領域并沒有更深入的研究。
【發明內容】
[0005] 為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種早老素PSl基因環化基因 序列，為阿爾茨海默病疾病的早期臨床診斷提供了理想的診斷marker。
[0006] 為解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下：
[0007] 早老素PSl基因環化基因序列，PSl基因的第2和第5外顯子首尾連接環化，早老 素PSl基因環化基因序列的編碼區的核巧酸序列為SEQIDNO. 1所示。
[0008] 進一步的，上述方案中，PCR擴增所述早老素PSl基因環化基因序列的引物序列為 下列引物對中的一對：
[0011] 早老素PSl基因環化蛋白，早老素PSl基因環化蛋白的核巧酸序列為SEQIDNO.I 所示。
[0012] 本發明的另一目的在于提供所述早老素PSl基因環化基因序列的表達方法，通 過反向PCR后克隆測序的方法在人神經母細胞瘤SY5Y細胞系中鑒定出了人早老素基因 P沈Nl(presenilin1，PS1)的一種環化的分子。
[0013] 一種早老素PSl基因環化基因序列的表達方法，所述表達方法步驟如下：
[0014] 1)提總RNA:提取甜-SY5Y細胞的總RNA;
[001引。除去提取的RNA中殘留的基因組DNA:在上述提取的總RNA中加入反應液，經過 消化、滅活后除去殘留的基因組DNA ;
[001引扣將RNA逆轉錄成CDNA :在PCR管中加入上述RNA作為模板、采用隨機逆轉錄引 物，在PCR體系中逆轉錄成CDNA ;
[0017] 4)引物設計及PCR擴增克隆測序：根據PSl基因的RNA序列設計12對反向PCR擴 增引物SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 25,先反向擴增PCR擴增PSl的外顯子，電泳檢測PCR產 物，然后將PCR產物克隆到PMD18-TA克隆載體中，用上述引物進行PCR反應，反應完取PCR 產物電泳；將PCR產物切膠回收，使用膠回收試劑盒回收純化，然后用T4連接酶將目標片段 連接到PMD18-TA克隆載體中，再將產物轉化到D冊a大腸桿菌，過夜培養；第二天挑取單克 隆做DNA測序鑒定，第2和第5外顯子首尾連接環化，即CDNA核巧酸序列如SEQ ID NO: 1 所示的早老素PSl基因環化基因序列。
[0018] 進一步的，上述表達方法中，步驟4)的PCR反應體系為20微升體系：具2XPCR MIXIOyL，IOmM上、下游引物各1化，cDNA模板1化，用滅菌水補足20yL;反應條件為： 95°C5min預變性，循環內95°C80s變性，58°C80s退火，72°C延伸30s，共30個循環，PCR反 應循環后72°C繼續延伸5min，然后16°C保存。
[0019] 進一步的，上述表達方法中，步驟1)采用Lifetechnologies公司生產的 T財Z0.1? Reagent試劑盒提取總RNA。
[0020] 進一步的，上述表達方法中，步驟2)的反應液總體積為20^以由如下組分組成：
[0021] RNA 如 L DNase I 2 睞 IOxbuffer 2|iL H,0(RNase free) 10沖；
[002引步驟1)提取的提取的總RNA在上述反應液中于37°C消化30min后，加入0.5y1 邸TA, 65°C滅活IOmin。
[0023] 進一步的，上述表達方法中，步驟3)逆轉錄的PCR體系為：
[0024] RNALSjig 民andom引勒 0.5]iL 2 X民T Mix 5山L RT Enzyme Mix I)xL
[00巧]RNase free(1地2〇uptoI補足至 10yL;
[0026]反應條件為：25°C5min，42°C20min，85°C5min，4°C2min。
[0027] 早老素PSl基因環化基因序列的巧光定量檢測方法，該巧光定量檢測方法包括W 下步驟：
[0028] I)提總RNA:提取甜-SY5Y細胞的總RNA;
[002引。除去提取的RNA中殘留的基因組DNA:在上述提取的總RNA中加入反應液，經過 消化、滅活后除去殘留的基因組DNA;
[0030] 3)將RNA逆轉錄成CDNA:在PCR管中加入上述RNA作為模板、采用隨機逆轉錄引 物，在PCR體系中逆轉錄成CDNA;
[0031] 4)采用巧光定量反應Real-timePCR試劑盒，配置反應體系對老年癡呆患者血液 標本進行檢測，體檢測反應體系如下：
[0032] CDNA ]0沖 上游引物 0.5咕 下游引物 0.5地 2xSYB民Gr燃打PL民M游terMfe 1邸L dH,() 8 0以
[0033]其中，上游引物為：5，TGTATAAATACAGGTGCTATAAGACCTAA3，
[0034]下游引物為：5'TGCAGGTAACTCTGTCATTGG;
[0035] 巧光定量PCR反應條件為95°C5分鐘變性；95°C10秒，60°C35秒；40個循環，溫 度6(TC-95°C收集巧光信號，然后進行融解曲線分析。
[0036] 相比現有技術，本發明的有益效果在于：
[0037] 1.本發明針對12個外顯子分別設計反向PCR引物，來擴增可能存在的環化的 RNA;獲得了一種由PSlmRNA的第2、3、4、5外顯子環化而成的環化基因序列，此環化基因序 列全長序列為615個核巧酸；
[003引 2.本發明所述的早老素PSl基因環化基因序列可成為更加理想的檢測阿爾茨海 默的早期臨床診斷指標；W后對PSl基因環化基因生理學功能的和開發預防治療阿爾茨海 默的祀點藥物打下基礎。
[0039] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0040] 圖1為本發明的實施例1的早老素PSl基因環化基因DNA序列測定峰圖結果圖， 其中，箭頭指示為環化連接點；
[0041] 圖2為PSl基因mRNA模式結構圖圖示顯示基因由12個外顯子組成；
[0042] 圖3為實施例1-12PCR擴增的環狀PSl瓊脂糖電泳圖共12個泳道M為DNA分子 量marker,其中1-12分別對應實施例1-12;
[0043] 圖4為本發明所述的早老素PSl基因環化基因組成結構示意圖；
[0044] 圖5為本發明所述的早老素PSl基因環化基因巧光定量檢測引物設計模式圖；
[0045]圖6為巧光定量檢測中線性PSl基因巧光定量引物設計模式圖；
[0046] 圖7為應用實施例1中早老素PSl基因環化基因在正常組和病人組表達性差異 圖；
[0047] 圖8為線性PSlmRNA在正常組和病人組表達性差異圖。
【具體實施方式】
[0048] 進一步的，上述方案中，PCR擴增所述早老素PSl基因環化基因序列的引物序列為 下列引物對中的一對：
[0050] 早老素PSl基因環化蛋白，早老素PSl基因環化蛋白的核巧酸序列為SEQIDNO. 1 所示。
[0051] 本發明的另一目的在于提供所述早老素PSl基因環化基因序列的表達方法，通 過反向PCR后克隆測序的方法在人神經母細胞瘤SY5Y細胞系中鑒定出了人早老素基因P沈Nl(presenilin1，PS1)的一種環化的分子。
[0052] -種早老素PSl基因環化基因序列的表達方法，所述表達方法步驟如下：
[0053] 1)提總RNA:提取甜-SY5Y細胞的總RNA;
[0054]。除去提取的RNA中殘留的基因組DNA:在上述提取的總RNA中加入反應液，經過 消化、滅活后除去殘留的基因組DNA;
[005引 3)將RNA逆轉錄成CDNA:在PCR管中加入上述RNA作為模板、采用隨機逆轉錄引 物，在PCR體系中逆轉錄成CDNA;
[0056] 4)引物設計及PCR擴增克隆測序：根據PSl基因的RNA序列設計12對反向PCR擴 增引物SEQIDNO. 2-SEQIDNO. 25,即P1-P12,先反向擴增PCR擴增PSl的外顯子，電泳檢 PCR產物，然后將PCR產物克隆到PMD18-TA克隆載體中，用上述引物進行PCR反應，反應 完取PCR產物電泳；將PCR產物切膠回收，使用膠回收試劑盒回收純化，然后用T4連接酶將 目標片段連接到PMD18-TA克隆載體中，再將產物轉化到D冊a大腸桿菌，過夜培養；第二天 挑取單克隆做DNA測序鑒定，第2和第5外顯子首尾連接環化，即CDNA核巧酸序列如SEQ IDNO: 1所示的早老素PSl基因環化基因序列。
[0057] 進一步的，上述表達方法中，步驟4)的PCR反應體系為20yL體系：2XPCRMIX 10化，IOmM上、下游引物各I化，cDNA模板I化，用滅菌水補足20yL;反應條件為： 95°C5min預變性，循環內95°C80s變性，58°C80s退火，72°C延伸30s，共30個循環，PCR反 應循環后72°C繼續延伸5min，然后16°C保存。
[0058] 進一步的，上述表達方法中，步驟1)采用Lifetechnologies公司生產的 TRIz〇r"Reagent試劑盒提取總RNA。
[0059] 進一步的，上述表達方法中，步驟2)的反應液總體積為20^以由如下組分組成：
[0060] RNA 6uL DNase T 解 10 Xtoft紅 2曲 化0(RNase fVee) 10胖;
[0061] 步驟1)提取的提取的總RNA在上述反應液中于37°C消化30min后，加入0. 5y1 邸TA, 65°C滅活IOmin。
[0062] 進一步的，上述表達方法中，步驟3)逆轉錄的PCR體系為：
[0063] 瞄始 1.5