一種γ-谷氨酰轉肽酶的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因工程技術領域，具體地說，是利用高密度發酵結合k谷氨酷胺及 MD的復配極大地提高了谷氨酷轉膚酶轉移酶的表達及可溶性表達，使GGT酶活提供了 3-5 倍，獲得了一種丫-谷氨酷轉膚酶（gamma-GGT酶）的高效制備技術，明顯降低了酶法合成 k茶氨酸的生產成本。
【背景技術】
[0002]k茶氨酸（N-乙基-丫谷氨酷胺，theanine)是一種天然的氨基酸，是茶葉中的特 征氨基酸，也是茶葉中有效的呈味物質。心茶氨酸主要用于：（1)作為一種新興的食品添 加劑，可用作為茶飲料的品質改良劑、改善食品風味的添加劑、功能食品的添加劑、"情緒食 品"的添加劑等；已在歐美、日本、中國臺灣等國家、地區廣泛使用。如日本已開發出添加茶 氨酸的巧克力、果凍、布下、口香糖、保健茶和各種清涼飲料。（2)作為醫藥中間體領域，茶氨 酸可W用作抗腫瘤、降血壓、安神鎮靜、抗疲勞等藥物中。此外k茶氨酸現已作為鎮靜劑中 的有效成分，對帕金森氏癥、老年性癡呆、傳導神經功能素亂等疾病起預防效果。
[0003]k茶氨酸的生產方法主要有茶葉提取法、化學合成法、微生物發酵酶轉化法。（1) 茶葉提取法由于茶葉中茶氨酸的含量不高，從茶葉提取茶氨酸無法實際生產價值。所W植 物提取法實際上是從提取茶多酪后的殘留液中用離子交換樹脂法提取茶氨酸。缺點是生產 工序復雜、產品純度低、產量小、價格高。（2)化學合成心茶氨酸需要高溫、高壓及化學催 化劑等條件，反應條件要求比較高，副產物多，且產生的都是Dk型消旋體，還需要進行拆 分才能得到k型產品。因此會使成本提高W及質量難W控制，且易混雜有毒物質，產品不 宜用于食品行業應用，同時生產工藝復雜，且易造成環境污染。（3)微生物發酵酶轉化法生 產的k茶氨酸都是L型的，且生產成本低，可大量生產，由于生物酶法合成具有高度的專一 性，所W在產品質量方面更接近天然的k茶氨酸，其發展前景非常廣闊。此外酶轉化法生 產k茶氨酸還具有純度高、副產物少、純化步驟少、生產能力強等優點，因此微生物發酵酶 轉化法是目前國內外研究人員公認的最直接、最經濟的k茶氨酸生產方法。
[0004] 利用微生物發酵酶轉化法生產k茶氨酸的酶主要有谷氨酷胺酶和丫-谷氨酷轉 膚酶（丫-GGT)，本實驗是研究利用大腸桿菌發酵產丫-谷氨酷轉膚酶，該大腸桿菌高產高 酶活的丫-谷氨酷轉膚酶，能高效轉化谷氨酷胺和乙胺為心茶氨酸；近些年來，盡管有研究 把大腸桿菌K-12來源的丫-ggt基因（全長序列或突變缺失序列）導入到大腸桿菌中表達， 通過采用不同的融合標簽的載體或大小亞基的共表達，但重組谷氨酷轉膚酶常常W沒有活 性的包涵體或沒有活性的酶原形式被表達出來。究其原因，主要是谷氨酷轉膚酶復雜的翻 譯后加工過程，造成表達和轉運后的大小亞基不能正確折疊并且不能有效地相互作用，因 此不能形成天然的成熟酶。運樣的事實使得高效過表達具有生物活性的谷氨酷轉膚酶成為 一個難題。因而，尋求新的方法改進基因工程菌的高效表達W從根本上提高茶氨酸的合成 量顯得尤為重要。
【發明內容】
陽〇化]本發明所要解決的是提供一種高密度發酵結合酶表達促進劑，用于高效表達可溶 性谷氨酷轉膚酶方法，W便于酶轉化合成茶氨酸。
[0006] 本發明提供的一種gamma-GGT酶的制備方法，該方法是：將谷氨酷轉膚酶表達質 粒轉化到大腸桿菌構建基因工程菌、對基因工程菌進行發酵、并利用IPTG或乳糖進行誘導 表達，在誘導表達結束前3小時，加入含k谷氨酷胺及MD的復配促進表達。
[0007] 進一步地，對工程菌的發酵采用高密度發酵方法：在M9培養基的基礎上通過不斷 補充含甘油的新鮮培養基，使發酵0D600達到10 W上后進行蛋白誘導表達。
[0008] 技術用于生產茶氨酸主要包括W下步驟：
[0009] 谷氨酷轉膚酶高效可溶性表達及茶氨酸的生產，包括如下步驟：
[0010] (1)將谷氨酷轉膚酶表達質粒轉化到大腸桿菌化21 0E3)中；
[0011] (2)對工程菌進行高密度發酵；
[0012] (3)利用IPTG或乳糖進行誘導表達；
[0013] (4)誘導表達結束前3小時，加入含心谷氨酷胺（2克/升）及氧化型煙酷胺腺嚷 嶺二核巧酸NAD+ (0. 5克/升）的復配；
[0014] 巧)3小時后收菌，經細胞破碎后進行gamma-GGT酶活測定。
[0015] 步驟（1)中，所選擇的谷氨酷胺轉膚酶表達質粒為Pgex-4t-l-ggt，該質粒來源于 GE公司，帶有氨節青霉素抗性。
[0016] 步驟（3)中，誘導表達的方法為：將步驟（2)得到的工程菌接種于含氨節青霉素抗 性的M9液體培養基，37°C，220巧m/min振蕩培養12h;將活化好的菌按1 :50比例接入含有 100mL氨節青霉素抗性的M9液體培養基中，37°C振蕩培養至適當的0D600值后，按5%的接 種量加入5升發酵罐；不斷補充含甘油的新鮮培養基進行高密度發酵，當發酵液的0D600達 到10W上后，加入適量的IPTG或乳糖，20°C下培養。
[0017] 步驟（4)中，在0D600達到30后，加入含k谷氨酷胺及NAD的復配。
[0018] 步驟巧），3小時后離屯、收集菌體，經過細胞破碎后，谷氨酷轉膚酶表達量測定方 法為WesternBlot,其酶活測定按照上海生物工程有限公司的GGT試劑盒方法進行。
[0019] 所采用的酶促合成茶氨酸的基因工程菌化21/C4是經過步驟（4)優化的具有極高 谷氨酷轉膚酶酶活，且其發酶液直接作為谷氨酷轉膚酶的來源。該方法的要點在于，經高密 度培養后，菌體濃度達到0D600，但由于GGT蛋白本身的溶解性較差，誘導的GGT酶主要W包 涵體形式存在，因此酶活性仍然不高，通過加入含k谷氨酷胺及MD的復配后，由于k谷 氨酷胺為GGT底物，利用誘導契合原理極大地促進了GGT的可溶性表達，且NAD能夠通過快 速提供合成蛋白的能量，因此通過兩者的有機的結合，使GGT酶活提供了 3-5倍。
[0020] 有益效果：本發明應用工程菌高密度發酵結合酶活表達促進劑，通過高效表達酶 法生產茶氨酸，使用本發明方法可W明顯的提高酶的表達量及酶活，促進底物的轉化，進而 提高茶氨酸的生產量。同時，縮短了工藝周期（酶活性好），降低了生產成本（降低酶促反 應中酶耗成本），易操作，易放大，穩定性好，適于大規模工業化生產，為生物酶法生產其