一種固定化轉氨酶及其在合成西他列汀中間體中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種固定化轉氨酶，該固定化轉氨酶的 制備方法，W及該固定化轉氨酶作為催化劑在不對稱合成西他列汀中間體中的應用。
【背景技術】
[0002] 酶是一類由生物體產生的具有催化功能的生物大分子物質，作為一種生物催化 劑，酶在常溫常壓的溫和條件下能催化各種有機化學反應。酶催化具有高效性，比一般催化 劑的效率高出1〇7~10"倍；酶催化具有很高的專一性，可W減少或避免副反應，得到很高 純度的產物；酶催化反應還具有很高的立體選擇性和區域選擇性，無需保護與脫保護。酶的 送些優點大大促進了人們對酶的應用和酶技術的研究。但是，由于酶絕大多數屬于蛋白質， 其高級結構對環境十分敏感，各種因素如物理因素（溫度、壓力、電磁場等）、化學因素（氧 化、還原、有機溶劑、金屬離子、離子強度、pH等）和生物因素（酶修飾和酶降解等）均有可 能使其喪失生物活性。即使在最適條件下，酶也會逐漸失活，隨著反應時間的延長，反應速 度會逐漸下降；此外，反應后酶不能回收，只能采用分批法進行生產，送對于現代生物催化 工業來說，成本較高。
[0003]為了解決W上問題，人們設計了一種固定化酶，就是將酶束縛于某種特殊的介質 中，使它與反應體系分開，但仍能與底物進行分子交換。送種固定化酶與一般的固體化學催 化劑一樣，既具有催化特性，又具有能回收、反復使用等優點，生產工藝也可W實現連續化、 自動化。
[0004] 固定化酶的固定化方法包括吸附法、包埋法、交聯法與共價結合法。其中，吸附法 又可W分為物理吸附法與離子吸附法兩種，該方法條件溫和，酶活損失少，易于再生，但是 固定得不牢固，非常容易解吸附。包埋法主要采用海藻酸巧、卡拉膠、聚丙帰醜胺、尼龍膜或 硝酸纖維素微囊包埋，該方法一般較為溫和，酶活性損失少，但是傳質阻力很大，不利于較 大分子或很低溶解度底物的催化。交聯法中用的最多的是戊二醒交聯，一般操作較為簡便， 但是反應劇烈，酶活損失大；而且機械性能差，顆粒度細，難W分離。共價結合法常用芳胺載 體的重氮化反應、居基載體的漠化氯-亞胺碳酸鹽反應、駿基載體的撰二亞胺反應、琉基載 體的二硫鍵交換反應等，由于其結合牢固、穩定性好等特點，是目前研究與應用最為廣泛的 一類方法。但是該方法條件苛刻，反應劇烈，酶活損失大（一般殘余酶活在30%左右）。
[0005] 西他列汀磯酸鹽由默克公司開發，于2006年8月及10月分別被墨西哥衛生部及 美國抑A批準為治療II型糖尿病的藥物，商品名為捷諾維（Januvia),目前已經在全世界 60多個國家批準使用，2012年銷售額已達40. 86億美元，同比增長23%。因此，西他列汀磯 酸鹽是屬于國際最新且附加值極高的"重磅炸彈"，其合成的關鍵是手性胺中必的構建。
[0006] 美國專利US8293507公開了Codexis公司對節桿菌來源的轉氨酶進行改造得到的 生物催化劑來構建手性胺中必，轉氨化產物ee值達到99%，底物投料lOOg/L。但是由于底 物水溶性差，需要添加高達50%的DMSO助溶，使得產品的后處理損失較大，DMSO的溶劑殘 余較高，回收困難，成本較高。
[0007] 而后默克公司在中國專利申請CN103608355A中公開了利用環氧樹脂對該酶進行 固定化，使得反應得W在水飽和的己酸異丙醋中進行反應，但是并未公布該酶進行固定化 的酶活回收率。
[0008] 中國專利申請CN103014081A公開了蘇州漢酶公司利用轉氨酶將3-撰 基-4- (2, 4, 5-H氣苯基）-了酸甲醋轉化為R-3-氨基-4- (2, 4, 5-H氣苯基）-了酸甲醋， 但是并沒有公開具體轉氨酶的序列W及克隆方法。
[0009] 中國專利申請號201410169882. 4公開了本公司運用來源于分支桿菌 (Mycobacteriumvanbaalenii)PYR-I的轉氨酶對 3-撰基-4-(2, 4, 5-H氣苯基）-了酸甲 醋的不對稱轉氨化反應，由于該底物水溶性較高，因此具有較高的時空產率，具有一定的工 業化應用價值。但是，游離酶反應使得分離困難，不能重復利用。
【發明內容】
[0010] 本發明針對來源于分支桿菌（Mycobacteriumvanbaalenii)PYR-l的轉氨酶在酶 催化過程中分離困難，W及酶固定化過程中存在的酶活性損失大或傳質困難等問題，將商 品化的環氧樹脂依次用亞胺基二己酸（IDA)、氯化鉆進行衍生化，得到酶固定化載體，而后 用帶組氨酸標簽的分支桿菌（Mycobacteriumvanbaalenii)PYR-I來源的轉氨酶進行固定 化，并用肥02進行處理W提高酶的結合能力。該固定化方法反應溫和，酶活基本無損失。運 用該固定化酶對底物3-撰基-4- (2, 4, 5-H氣苯基）-了酸甲醋進行不對稱轉氨，可W重復 利用20批次，且分離簡單。
[0011] 本發明的內容之一是提供了 一種帶組氨酸標簽的轉氨酶。其可W通過本 領域常規方法將包括SEQNo. 1的轉氨酶基因的質粒（構建方法見中國專利申請號 201410169882. 4)，用限制性內切酶NdeI和EcoRI雙酶切，形成互補的粘性末端，與同樣 雙酶切的祀T28a載體經T4DNA連接酶連接，形成含有本發明的轉氨酶基因的重組表達質粒 祀T28a-MvAT表達質粒。將該表達質粒轉化大腸桿菌E.COli化2UDE3)，即可獲得本發明 的基因工程菌株，即E.COli化21 0E3)/祀T28a-MvAT。將該重組大腸桿菌接種至含卡郝霉 素的LB培養基（蛋白腺lOg/L，酵母膏5g/l，^CllOg/L，抑7. 0)中培養，當培養液的光密 度0D600達到0. 5~0. 7 (更佳地為0. 6)時，加入終濃度為0. 05~1.Ommol/L(更佳地為 0. 2mmol/L)的異丙基-目-D-硫代化喃半乳糖巧（IPTG)進行誘導，誘導溫度10~40°C(更 佳地為25C)，即可高效表達本發明所述的帶組氨酸標簽的重組轉氨酶。
[0012] 本發明的內容之二是提供了 一種酶固定化載體。
[0013] 將氨基樹脂加到己二醇二縮水甘油離中形成環氧樹脂，而后置于20mM亞胺基二 己酸aDA)，pH7.0-10.0(更佳地為抑9.0)的10mMH己醇胺溶液中，20-8(rC(更佳地為 65°C)反應3小時后，先后用水、2mMC0CI2、水進行洗涂，或直接用離子莖合樹脂先后用水、 2mMC0CI2、水進行洗涂，即得到酶固定化載體。
[0014] 在一個特定的實施方案中，本發明所述的氨基樹脂是上海華震公司的氨基樹脂， 特別是型號為D301的氨基樹脂；在另一個特定的實施方案中，本發明所述的離子莖合樹脂 是上海華震公司的離子莖合樹脂，特別是型號為HZ401的離子莖合樹脂。
[0015] 本發明的內容之H是提供了 一種固定化轉氨酶。
[0016] 該固定化轉氨酶是將本發明的重組轉氨酶固定于本發明的酶固定化載體上得到 的。
[0017] 將上述所得的帶組氨酸標簽的重組轉氨酶的抑為8. 5的20mM的H己醇胺溶液， 加入5-20倍重量（更佳地為10倍重量）的固定化載體，25C攬拌1小時，過濾洗涂后加到 IOmM的雙氧水溶液中，25C攬拌1小時后過濾洗涂即得固定化酶。所得的固定化酶酶活力 達到1543U/g，回收率為50%。
[0018] 本發明的內容之四是提供了本發明的轉氨酶或固定化轉氨酶在催化前手性撰基 化合物進行不對稱轉氨反應形成光學活性手性胺中的應用。
[0019] 上述應用中，所述的不對稱轉氨反應的各條件可按本領域此類反應的常規條件進 行選擇，優選如下：
[0020] 所述的轉氨酶優選本發明的固定化轉氨酶。
[0021] 所述的前手性撰基化合物較佳地為1-化4, 5-H氣苯基）-4-取代-2,4- 了二麗 類化合物，即是式I所示的化合物：
[0022]
[0023] 其中，R選自
[0024] (4)烷氧基；
[0025] 妨芳氧基；或
[0026] (6)
[0028]X選自（I)N,和似CR2 ;
[0029] Rl和R2獨立地選自：
[0030] (I)H,
[00引]似CN,
[0032] (3)直鏈或支鏈且未被取代或被1~5個因素原子取代的Cl-IO烷基。
[0033] 較佳地，R為碳鏈長度為1~8的烷氧基、予基、或
[0034]
[0035] 更佳地，R為-邸3、-邸2邸3、或
[0036]
[0037] 上述應用中，所述的不對稱轉氨反應的各條件可按本領域此類反應的常規條件進 行選擇，較佳地，所述的應用包括下述步驟：在抑7. 0~10. 0的磯酸-磯酸鋼緩沖溶液中， 在5-50%己醇、20~lOOg/L的異丙胺和0. 1~1.Ommol/L磯酸化唆醒（PLP)的存在下，在 50~300g/L的本發明所述的重組轉氨酶或固定化轉氨酶的催化下，10~60g/L的上述前 手性撰基化合物進行不對稱轉氨反應，形成光學活性手性胺。反應完成后通過過濾回收固 定化轉氨酶，水洗后投入下一批反應使用。重復利用20次未見轉化率的下降。
[0038] 在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實 例。
[0039] 本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0040] 本發明的積極進步效果在于：
[0041] 針對來源于分支桿菌（Mycobacteriumvanbaalenii)PYR-l來源的轉氨酶在 酶催化過程中分離困難，W及已報導的酶固定化過程中存在的酶活性損失大或傳質困 難等問題，提供了 一種結合牢固、酶活損失少的固定化酶，并用于酶催化合成R-3-氨 基-4- (2, 4, 5-H氣苯基）-了麗衍生物。相對于其它方法，本發明制備所得的固定化酶結合 牢固、酶活損失少、分離簡單、重復利用次數多，不對稱轉化過程成本低廉，反應條件溫和， 對環境友好，操作簡便，易于工業放大，因此具有很好的工業應用前景。
【附圖說明】
[0042] 圖1分枝桿菌PYR-I轉氨酶重組表達轉化體的菌落PCR圖。M為分子量標準，A為 E.COliD冊a/pET21a-MvAT,B為E.COli化21 0E3) /祀T28a-MvATd
[0043] 圖2重組表達的分枝桿菌PYR-I轉氨酶粗酶液的聚丙帰醜胺凝膠電泳圖。
[0044]M為分子量標準，A為誘導前，B為誘導后。
【具體實施方式】
[0045] 下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。下列實施例中未注 明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0046] 下列實施例中的材料來源為：
[0047] 祀T21a-MvAT由本公司構建