云芝液體發(fā)酵高產多糖菌株及其選育方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種云芝液體發(fā)酵高產多糖菌株及其選育方法。
【背景技術】
[0002] 云芝胞內多糖（Coriolusversicolorintracellu-Iarpolysaccharides)系 從擔子菌綱多孔菌科云芝屬真菌云芝或培養(yǎng)的菌絲中提取純化的結合蛋白多糖，是良好的 生物效應調節(jié)劑，具有抑制腫瘤、調節(jié)免疫、降低放、化療毒副反應等多種藥理作用，并有抗 艾滋病毒活性。由于野外云芝的資源有限，采用固體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體提取多糖成本高、周期 長、產品質量不穩(wěn)定、產量低，而且最近我國藥品監(jiān)督管理局要求由固體培養(yǎng)變更為液體培 養(yǎng)云芝菌絲體提取胞內多糖，所W為了彌補運些不足，適應大規(guī)模集約化生產。云芝多糖主 要來自液體發(fā)酵的菌絲體提取得到，目前云芝液體發(fā)酵提高多糖得率的研究大都是在云芝 液體發(fā)酵的條件及云芝多糖提取工藝上的研究很多，而通過菌種誘變，得到特異菌株來提 高發(fā)酵產物云芝多糖的含量，幾乎沒有報道，產量高、生物性狀優(yōu)異、生產性狀良好的云芝 菌種是保障云芝生產和云芝產業(yè)發(fā)展良好的先決條件，從野外分離的云芝菌種大多產量不 高，需要經過人工馴化和不斷的選育，W提高云芝的產量和生產性狀，因此，菌種的選育方 面的研究就顯得尤為重要。自然選育的效率較低，而采取人工選育的方法效果較好，云芝作 為一種大型真菌，有其自身的特點，其新菌種的選育研究離不開食用菌育種方面的研究。
[0003] 優(yōu)良的藥用真菌工程菌是提高藥用真菌液體發(fā)酵水平的關鍵。目前，對藥用真菌 采用的育種手段主要有自然選擇、誘變育種和雜交育種。除利用紫外線、激光和化學誘變 劑等物理化學誘變因素來篩選出優(yōu)良藥用真菌外，為了提高藥用真菌育種的有效性和目的 性，研究人員越來越重視利用原生質體融合技術、基因重組技術等來構建新型的藥用真菌 發(fā)酵工程菌。原生質體融合又稱細胞融合，該技術不受親合因子的影響，可實現(xiàn)藥用真菌的 種內不同品種間、種間W及屬間細胞中的全基因組的有效混合，使遺傳距離較大的遠緣種 間、屬間雜交成為可能。但由于雜合子鑒定標準上存在著技術難度而影響了該技術的廣泛 應用。
[0004] 在食用菌的菌種選育中，通常有許多難題，諸如新菌種的產量篩選周期長、工作量 大，菌種選育的效率不高等，采用傳統(tǒng)方法進行食用菌菌種選育，篩選到一株產量高、生物 性狀優(yōu)異、生產性狀優(yōu)良的高產新菌株的難度較大。因此，在食用菌菌種選育研究領域亟待 引進一種高效的新育種技術和工藝。
[0005]目前在微生物育種中，利用離子束進行誘變育種受到了追捧，離子束作為一種新 的誘變源在誘變育種方面因其獨特的誘變機理和生物效應而發(fā)展極為迅速，離子注入可引 起DNA鍵斷裂，致使大量受體原子移位、重組，形成新的分子結構和基因，產生豐富的基因 突變，從而提高突變率。與傳統(tǒng)誘變源相比，離子注入能W較小的生理損傷得到較高的突變 率、較廣的突變譜，而且具有設備簡單、使用方便、成本低廉、對人體和環(huán)境無害等優(yōu)點。近 年來，有報道將離子束誘變技術運用在抗生素菌株的誘變上，并獲得成功。許立青、張蔭芬 等人采用離子束注入法應用于核糖霉素、卡那霉素產生菌和卡那霉素抗株產生菌的誘變， 結果表明抗生素效價單位有明顯提高，用N+處理的生產菌株一慶大霉素和卡那霉素產生 菌，選出的高產菌株已用于生產，提高幅度分別為20%左右和12. 5%W上，經濟效益明顯。 2006年趙樹欣等人采用離子束注入法對一株酵母菌TQ601進行誘變選育，成功獲得一株產 高級醇低的菌株TQ105菌，比出發(fā)菌株降低了 34. 15%。離子束注入技術用于菌株的選育工 作，效果優(yōu)于傳統(tǒng)的誘變技術。
[0006]目前對于云芝新品種選育報導不多，國內外還未見有關利用離子束注入誘變選育 高產云芝多糖發(fā)酵菌株的相關報道，本項目的實施將填補運方面的空白。引進離子束誘變 技術運用于高產云芝多糖發(fā)酵菌株的選育，發(fā)揮其優(yōu)勢，大大提高誘變選育的成功率，在云 芝液體發(fā)酵菌株選育上建立一個新的高效方法，為真菌發(fā)酵技術的發(fā)展開辟新的道路。
【發(fā)明內容】
[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種云芝液體發(fā)酵高產多糖菌株及其選育方法。
[0008] 本發(fā)明的技術解決方案是：
[0009] -種云芝液體發(fā)酵高產多糖菌株，其特征是：保藏編號為CGMCCNo. 10903;分類 命名：云芝，拉下文學名：Co;riolusversicolor。
[0010] 所述的云芝液體發(fā)酵高產多糖菌株，發(fā)酵條件為：發(fā)酵罐容積100以裝液量60以 攬拌轉速15化/win,通氣量1 :0. 5-1，壓差法接種，接種量為8%，27~28°C條件下培養(yǎng)； 添加0. 1 %豆油作為消泡劑；發(fā)酵終止時間為60小時；發(fā)酵培養(yǎng)基：每升發(fā)酵液用玉米粉 30邑，豆餅粉15g，蛋白腺3g，葡萄糖30g，碳氮比為19:1。
[0011] 一種云芝液體發(fā)酵高產多糖菌株的選育方法，其特征是：包括下列步驟：
[0012] (1)選擇多種不同的云芝生產菌菌株，進行云芝的液體發(fā)酵試驗，挑選云芝菌絲體 多糖產量最高的云芝菌株作為誘變的高產出發(fā)菌株；
[0013] (2)出發(fā)菌株利用原生質體制備技術，進行云芝原生質體的制備；
[0014] (3)云芝出發(fā)菌株的原生質體作為低能妒離子注入誘變的材料：通過云芝原生質 體的制備，并使云芝原生質體達到106個/ml的懸液，吸取0.Iml涂布于空白培養(yǎng)皿中，風 干、進行低能妒離子注入誘變；
[0015] (4)妒離子注入誘變：對步驟（3)涂布于培養(yǎng)皿中的材料進行N+離子注入誘變，然 后用Iml0.6mol/L薦糖滲透壓穩(wěn)定劑洗脫，吸取0.Iml洗脫液涂布于再生平面培養(yǎng)基上培 養(yǎng)；
[0016] (5)誘變菌株的篩選：將經離子束注入后的平板用0. 6mol/L薦糖滲透壓穩(wěn)定劑洗 脫，涂布于再生培養(yǎng)基平板上，待菌落長成后，挑選菌絲粗壯濃密、生長較快的菌絲進行液 體發(fā)酵試驗，對菌絲體多糖進行測定，挑選菌絲體多糖含量比出發(fā)菌株高的云芝菌株，對其 進行篩選培養(yǎng)，最后得到一株液體發(fā)酵高產多糖的云芝新菌株；
[0017] (6)遺傳性狀穩(wěn)定性驗證：將上述誘變篩選后的菌株連續(xù)傳代20代，然后進行液 體發(fā)酵試驗，產量穩(wěn)定、性狀無變化的最終確定為用于生產上的新的誘變云芝液體發(fā)酵工 程菌株。
[001引所述的妒離子注入條件為注入能量為20KeV，注入劑量為9X1014ions/cm2,祀室 真空度為l0-3pa，W5s脈沖式注入，間隔為15s。
[0019] 再生培養(yǎng)基為：麥芽糖5克，葡萄糖10克，酵母粉4克，0. 6mol/L甘露醇，瓊脂5. 5 克、pH自然，蒸饋水定容至總體積為lOOOmL。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果是：
[0021] 1、W往云芝等食用菌菌種的育種通常采用雜交育種和紫外誘變育種等手段進行， 誘變效率低、易導致負突變、遺傳性狀不穩(wěn)定等缺點，而通過采用離子注入技術誘變云芝等 食用菌原生質體進行菌株的誘變選育，提高了誘變的效率和正突變的機率，并且誘變后的 云芝菌株不易發(fā)生退化。采用本發(fā)明誘變出一株云芝菌絲體多糖產量高于原出發(fā)菌株的云 芝誘變菌株，提高了云芝多糖的產量可W創(chuàng)造很好的經濟效益。
[0022] 2、本發(fā)明通過對高產多糖的云芝新菌株最佳最佳培養(yǎng)條件及最佳液體發(fā)酵參數(shù) 的研究，W發(fā)酵產物多糖為指標，從培養(yǎng)基的營養(yǎng)、pH、發(fā)酵時間等進行篩選適合高產多糖 新菌株的最佳發(fā)酵參數(shù)，從搖瓶培養(yǎng)到工廠發(fā)酵生產的不同發(fā)酵參數(shù)，提高工廠化生產云 芝多糖的得率，為工廠化生產云芝多糖提供成熟的工藝。
[0023] 3、通過低能N+注入誘變得到一株液體發(fā)酵高產多糖的云芝新菌株，對新菌株最 佳培養(yǎng)基及液體參數(shù)的研究使發(fā)酵云芝多糖產量高于高產出發(fā)菌株50%，每升液體發(fā)酵 量菌絲體多糖達到2. 26克。
[0024] 下面結合實施例對本發(fā)明工藝作進一步說明。
[00巧]低能N+注入誘變選育抗病高產云芝菌株的方法及所選育的菌株，保藏編號為CGMCCNo. 10903 ;分類命名：云芝，拉下文學名：Co;riolusversicolor,保藏單位：中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏 日期2015年06月11日。
【具體實施方式】
[0026] 誘變篩選云芝液體發(fā)酵高產多糖新菌株的工藝方法，其步驟是：
[0027] 1、高產云芝菌絲體多糖出發(fā)菌株篩選
[0028] 從國內引進不同品種的云芝菌種SYZ1、SYZ2、SYZ3、SYZ4、SY巧、SYZ6、SYZ7、SYZ8。 菌株分別來自中國農科院，東北，及本研究所保藏的菌株，接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，28°C 避光培養(yǎng)7天進行活化。將活化的菌株接種于裝有PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)皿的中央，記錄云芝菌 絲萌發(fā)的時間，測定其生長速度，觀察菌絲的形態(tài)（菌絲粗細、濃密）。接著進行云芝液體 發(fā)酵試驗，通過打孔定量接種至液體培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基配方見下），150轉/分旋轉式搖床 28°C避光培養(yǎng)7天，4000轉/分離屯、5分鐘，收集菌絲體，65°C烘干至恒重，測定其質量得云 芝液體發(fā)酵生物量，同時進行云芝菌絲體多糖進行測定。W云芝菌絲體多糖產量最高者作 為云芝多糖高產出發(fā)菌株。試驗最后確定WSYZ2來自中國農科院的一株云芝菌株作為誘 變的高產出發(fā)菌株。（見表1)
[0029] 高產菌絲體多糖出發(fā)菌株篩選（表1)
[0032] 2、低能妒離子注入誘變
[003引（1)樣品前處理：出發(fā)菌株SYZ2培養(yǎng)5天的菌絲，用2%溶壁酶在30°C下酶解5小時，用8層擦鏡紙過濾酶解液，用滲透壓穩(wěn)定劑共8ml分次洗涂過濾，取過濾液。400化/min 離屯、