對殺菌劑抗性且不產黃曲霉毒素的黃曲霉生防菌株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及農產品安全領域，尤其設及一種對殺菌劑抗性且不產黃曲霉毒素的黃 曲霉生防菌株及其應用。
【背景技術】
[0002] 黃曲霉毒素主要由黃曲霉（AspergillusfIavus)和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus)的代謝產物組成，是迄今發現的污染農產品毒性最強的一類生物毒素。其中， 毒性最強、危害最大的為黃曲霉毒素BI,其毒性為氯化鐘的10倍、祇霜的68倍，被列入嚴管 的特劇毒物質。農產品黃曲霉毒素污染已成為影響食品安全和危害人們身體健康的重要污 染物。
[0003] 據世界糧農組織估計，目前世界范圍內有25%的農作物產品受真菌毒素的污染， 其中主要就是黃曲霉毒素。黃曲霉毒素污染已對農產品輸出國的對外貿易已產生了嚴重影 響。黃曲霉毒素主要污染花生、玉米等作物，嚴重影響我國花生、玉米等作物及其制品的出 口，給我國的出口貿易帶來了巨大損失。因此，黃曲霉毒素的有效防治與控制，對于保障我 國食品安全和提升我國農產品出口競爭力具有重要意義。
[0004] 利用不產黃曲霉毒素菌株來抑制產毒菌菌群數量及產毒量的生物防治是目前控 制農產品黃曲霉毒素非常有效的手段。美國近來在黃曲霉毒素生物防治研究方面已取得重 大進展，已經批準兩個不產毒素的黃曲霉生防菌株（AF36和NRRL21882)，該黃曲霉生防菌 株在大田大面積使用，取得了顯著的經濟和社會效益。利用不產黃曲霉毒素的黃曲霉菌株 NRRL21882能有效防治花生黃曲霉毒素污染，其防效可達90%W上，使花生中黃曲霉毒素 的含量能有效控制在限量標準范圍內。我國在黃曲霉毒素生防防治方面還處于初步階段， 暫無登記的防治黃曲霉的生防菌劑。篩選、開發利用防治黃曲霉毒素的生物農藥，對解決我 國農產品黃曲霉毒素污染問題將具有重要的應用價值。 陽0化]在農業生產中，使用不產毒素的黃曲霉生防菌株來抑制毒素面臨一個重要的不利 因素，即農用殺菌劑。農田系統中，為了防治其他真菌病害，殺菌劑的使用是不可避免的。常 見的不產毒素的黃曲霉生防菌株對殺菌劑敏感，殺菌劑的使用將會抑制運些生防菌種群在 農田系統中的增殖，從而影響生防效果及防效穩定性。
[0006] 因此，篩選抗常用殺菌劑的不產黃曲霉毒素的黃曲霉生防菌株將能提高生防效果 的穩定性，對防治黃曲霉毒素有著重要應用價值。
【發明內容】
[0007] 本發明提供了一種對殺菌劑抗性且不產黃曲霉毒素的黃曲霉生防菌株及其應用。 該黃曲霉生防菌株不僅能有效抑制玉米和花生中黃曲霉毒素的形成，降低農產品中黃曲霉 毒素的污染；還對常用殺菌劑多菌靈、戊挫醇和阿米西達具有較高抗性，能夠有效降低農田 系統中殺菌劑對其種群增殖的抑制作用，從而維持生防菌的生防效果。 陽OO引本發明提供了一種黃曲霉生防菌株，命名為黃曲霉（Aspergillusflavus)AF054， 保藏編號為CGMCCNO. 9860,保藏日期為2014年11月20日。
[0009] 所述黃曲霉（Aspergillusflavus)AF054對常用的殺菌劑多菌靈、戊挫醇和阿米 西達均具有較高的抗性。
[0010] 具體地，AF054在含10yg/mL多菌靈或25yg/mL戊挫醇或100yg/mL阿米西達 的PDA平板上生長速率與不加藥的對照無顯著差異。
[0011] 所述黃曲霉生防菌株的生物學特征為：菌落呈黃綠色，產生分生抱子；分生抱子 梗的長度為700ym~1200Jim，直徑為11Jim~16Jim，頂囊近球形；分生抱子為球形或近 球形，直徑為3. 5Jim~4. 5Jim，抱子表面粗糖。 陽01引 本發明黃曲霉菌株AF054缺乏黃曲霉毒素合成基因C2、C3、norB、cypA、aflT、 pksA、aflR、aflj、adhA、estA、norA、adhA和vbs。
[0013] 本發明還提供了所述黃曲霉生防菌株在抑制產黃曲霉毒素的黃曲霉生長中的應 用。
[0014] 具體地，所述黃曲霉生長在農產品中。
[0015] 所述的農產品為谷物、油料作物、堅果、香辛料、飼料原料、中草藥或水果。優選地， 所述的農產品為玉米或花生。
[0016] 本發明還提供了一種用于抑制產黃曲霉毒素的黃曲霉產毒的生防菌劑，所述菌劑 的活性成分為所述的黃曲霉生防菌株。
[0017] 作為優選，所述的生防菌劑中，所述黃曲霉生防菌株的的抱子數為2~5X105個/ ITlLO
[0018] 所述的生防菌劑的制備方法，包括：W小麥為基質，將小麥浸泡、高溫滅菌后，接 種黃曲霉菌株，在28°C溫度、0. 04-0. 06Mpa氣壓下發酵48小時。發酵終止后，將溫度升至 40°C，攬拌烘干的發酵產品。
[0019] 與現有技術相比，本發明具有W下有益效果：
[0020] (1)本發明分離獲得的黃曲霉不產黃曲霉毒素，能有效抑制農產品中的黃曲霉毒 素的形成，降低農產品中黃曲霉毒素的污染，提高農產品質量；
[0021] (2)本發明獲得的不產黃曲霉毒素的黃曲霉菌株AF054具有對常用殺菌劑多菌 靈、戊挫醇和阿米西達的抗性，克服了現有生防菌劑對農田系統中殺菌劑的敏感性問題，有 效提高了生防菌株在田間的適生性和定殖能力，從而提高了生防菌的生防效果。
【附圖說明】 陽02引圖1為本發明黃曲霉菌株AF054中黃曲霉毒素合成基因缺失示意圖。 陽02引圖2為本發明黃曲霉菌株AF054對多菌靈、戊挫醇和阿米西達的抗性示意圖。
【具體實施方式】
[0024] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[00巧]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0026] 黃曲霉毒素Bl購于Sigma公司。
[0027] 實施例1不產黃曲霉毒素的黃曲霉菌株AF054的分離、鑒定 陽02引 1、從±壤、玉米、花生等生境中分離黃曲霉菌株
[0029] 從江蘇、浙江、山東、福建、安徽等地的玉米、花生田塊中采集±壤，將該±壤用YES 培養基培養分離黃曲霉菌株。每升YES培養基成分：酵母提取物Ig,薦糖lOg，化Cl60g，瓊 脂20g，滅菌后加入CuS04.ZnS04l血，0.4%氯硝胺5ml，鏈霉素100yg/mL。
[0030] 2、用生物測定、薄層層析W及酶聯免疫法分析菌株產生黃曲霉毒素的情況。 陽0川具體如下；
[0032] 生物測定方法：將分離到的黃曲霉菌株接種在含0.3 %環狀糊精的YES培養基上， 30°C培養7天后，將菌落用25%氨水熏蒸3分鐘，如果菌落背面呈粉紅色，該菌株為產毒菌 株；如果菌落背面不變色，該菌株可能是不產毒素菌株，需進行下一步的薄層層析檢測。薄 層層析測定方法：將分離到的黃曲霉菌株接種在含0. 3%環狀糊精的YES培養基上，3(TC培 養7天后，收集100毫克菌絲和抱子，置于1. 5毫升的離屯、管中，并向其中加入200微升的 80%甲醇；室溫下震蕩30分鐘后10,OOOg離屯、5分鐘，取50微升上清液點到硅膠層析板上， 吹干后將薄層層析板置于展布槽內用無水乙酸預展12厘米，取出涼干后在經過丙酬：=氯 甲燒（8:9。展開10~12cm，然后，取出層析板，365nm紫外燈下觀測，有淡藍色銀光斑點的 菌株為產毒菌株；如果沒有淡藍色銀光斑點，說明該菌株很可能是不產毒菌株，運些菌株可 進行下一步分子生物學檢測。
[0033] 酶聯免疫法檢測菌株是否產生黃曲霉毒素：按照中華人民共和國國家標準GB/ T5009. 22-2003《食品中黃曲霉毒素Bl的測定》方法，并利用北京市營養源研究所研發的 ELISA定量試劑盒定量檢測黃曲霉毒素Bl。
[0034] 通過上述方法分析，篩選出不產黃曲霉毒素的菌株AF054,分離自浙江省紹興市的 上壤。
[0035] 3、菌株的分子鑒定
[0036] 通過巧調基因序列對真菌AF054進行分子鑒定（Ro化igues P, Santos C,VenaneioA, LimaN.，2011. Species identification of Aspergillus section Flavi isolates from Portuguese almonds using phenotypic, including MALDI-TOF ICMS, and molecular approaches.JAppl Microbiol. 111(4):877-92.)黃曲霉基因組巧調基因cmdA 的PCR擴增所用的引物為化I和化2A，序列為：
[0037] CLl :5> -GARTWCAAGGAGGCCTTCTC-3> 陽的8] CL2A:5' -TTTTTGCATCATGAGTTGGAC-3'。
[0039]PCR反應的體系為：1yLDNA模板（約 4ng)，0.ImM引物各 1yL，IOmMdNTP 0. 5yL25mMMgC122yL，10Xbuffer2. 5yL，聚合酶 1.抓個單位，雙蒸水補足至 25yL。 W40] 反應條件為：95 °C預變性3min，94°C變性40s，各組引物53 °C退火40s，72 °C延伸 Imin，進行35個循環，最后72°C延伸lOmin。
[0041] PCR產物經純化后送至華大基因進行測序。測序結果在BLAST researches上比對 測序結果化ttp://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。 陽0創菌株AF054的巧調蛋白基因的PCR擴增產物的測序結果分別如SEQIDNO. 1所 示。序列在NCBI上對比結果顯示，菌株AF054與黃曲霉菌標準菌株NRRL3357的同源性為 100%。
[0043]菌株AF054在YES培養基上菌落生長較快，30°C條件下5天可長滿直徑9cm的培 養皿；菌落黃綠色，產生大量分生抱子；分生抱子梗長度一般為700Jim~1200Jim，直徑為 11Jim~16Jim，頂囊近球形；分生抱子球形或近球形，直徑3. 5Jim~4. 5Jim，抱子表面粗 糖。符合黃曲霉菌株的特征。
[0044] 綜上，通過上述各方法從±壤、花生上，分離、篩選和鑒定出不產黃曲霉毒素的黃 曲霉菌株AF054,并對菌株進行了保藏。
[0045] 菌株保藏說明：
[0046] 菌株名稱：黃曲霉；拉下名：AspergillusfIavus;菌株編號：AF054 ;
[0047] 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、；
[0048]保藏號：CGMCCNO. 9860。 W例保藏機構簡稱：CGMCC;
[0050] 地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號；保藏日期：2014年11月20日；
[0051] 實施例2不產黃曲霉毒素的黃曲霉菌株AF054中黃曲霉毒素合成基因缺失鑒定 陽0巧 （1)引物合成 陽053] 為明確不產黃曲霉毒素的黃曲霉菌株AF054中黃曲霉毒素合成基因缺失情況， 試驗參考 了文獻F*erng-KuangQiang(Qiang,P.K. ,Horn,B.W.andDorner,J.W. (2005)Sequencebre曰kpointsinthe曰fl曰toxinbiosynthesisgenecluster曰ndfl曰nking regionsinnonafIatoxigenicAspergillusflavusisolates.FungalGenetBio 42, 914 - 923.)中設計的關于毒素合成基因的鑒定引物，對菌株AF054中相關基因進行了 缺失情況鑒定。
[0054]似基因缺失鑒定 陽化5] W提取的黃曲霉菌株AF054的DNA為模板，分別用W上引物進行常規PCR反應，每 個反應均有產毒黃曲霉菌株DNA對照和