重組內皮抑素的新型純化復性方法及其抗腫瘤應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程W及生物醫藥領域，更具體地，本發明涉及重組內皮抑素的 新型純化復性方法及其抗腫瘤應用。
【背景技術】
[0002] 抑制血管生成已經成為臨床抗腫瘤治療的新祀點。腫瘤的發生、生長和轉移依賴 于腫瘤周圍的血管提供營養和途徑，沒有正常血供的腫瘤最大生長不超過l-2mm2。切斷腫 瘤組織的血液供應就有可能間接殺死腫瘤細胞并抑制腫瘤細胞的轉移，從而達到治療腫瘤 的目的。更重要的是，傳統的細胞毒性化療藥物都會因劑量累積導致嚴重的細胞毒效應，并 且由于腫瘤細胞本身的基因異質性導致耐藥性的產生，極大地限制了此類化療藥物對腫瘤 的治療效果。因此聯合使用血管生成抑制藥成為了目前臨床研究的新熱點。
[0003] 目前在臨床試驗期的重組人血管內皮細胞生長抑制素（riiEndostatin，rhED)多 來源于真核酵母表達系統，造價高且產率低，極大地限制了該蛋白藥物的臨床推廣使用。
[0004] 原核表達系統產生的內皮抑素因復性困難，可溶性蛋白的得率極低，研究實驗多 采用包涵體直接注射的方法進行，限制了其治療效果的有效性。
[0005] 鑒于上述現有技術中原核表達W及酵母表達重組人內皮抑素的困難因素，目前中 國已經上市的一種重組人內皮抑素其半衰期很短，僅2小時，極大地限制了其抗癌活性的 發揮。
[0006] 綜上，本領域迫切需要開發成本低廉、得率高的大規模生產內皮抑素蛋白的表達 和純化方法。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供重組內皮抑素的新型純化復性方法及其抗腫瘤應用。
[0008] 在本發明的第一方面，提供一種從重組人血管內皮細胞生長抑制素包涵體蛋白制 備可溶性蛋白的方法，所述方法包括：
[0009] (1)將重組人血管內皮細胞生長抑制素包涵體進行變性，獲得變性溶液；
[0010] (2)將（1)的變性溶液進行柱純化，獲得經過柱純化的溶液；
[0011] (3)應用透析液將（2)的經過柱純化的溶液進行梯度透析；透析液包括；醋酸鋼、 尿素、甘氨酸、EDTA，透析液P冊.0 + 0. 3 ;較佳地P冊.0 + 0. 2。
[0012] 在一個優選例中，所述的重組人血管內皮細胞生長抑制素的N末端起始密碼子之 后還包括H個氨基酸，依次為；精氨酸、甘氨酸和絲氨酸。
[0013] 在另一優選例中，步驟（1)中，所述的重組人血管內皮細胞生長抑制素包涵體溶 解于鹽酸脈中；較佳地，所述的鹽酸脈濃度為6+ 0. 5mol/L。
[0014] 在另一優選例中，所述的重組人血管內皮細胞生長抑制素攜帶化S純化標簽（較 佳地，His純化標簽存在于其C端；更佳地位于C端終止子之前）；
[0015] 并且，步驟（2)中，采用Ni-NTA柱純化。
[0016] 在另一優選例中，步驟（2)中，Ni-NTA柱純化方法包括：
[0017] (a)清洗親和柱，用8mol/L的尿素（較佳地5個柱體積，溶于磯酸鹽緩沖液， P冊.0)平衡系統；
[0018] 化）W 5ml/min的速度上樣所述的變性溶液，上樣結束后W P冊.0的磯酸鋼（較佳 地5個柱體積）洗脫雜蛋白；和
[001引 （C)WPH4. 5的磯酸鋼收集目的蛋白。
[0020] 在另一優選例中，步驟（3)中，Wmol/L為單位，所述的透析液包括：
[0021] 透析液A;醋酸鋼0. 25,尿素3,甘氨酸0. 5,邸TA0. 4 ;
[002引透析液B;醋酸鋼0. 25,尿素2,甘氨酸0. 5,邸TA0. 4;
[0023] 透析液C;醋酸鋼0. 25,尿素1. 5,甘氨酸0. 5,邸TA0. 4;
[0024] 透析液D;醋酸鋼0. 25,尿素1，甘氨酸0. 5,邸TA0. 4;
[00巧]透析液E;醋酸鋼0. 25,尿素0. 5,甘氨酸0. 5,邸TA0. 4;
[0026] 透析液F;醋酸鋼0.2,甘氨酸0.25;
[0027] 透析液G;醋酸鋼0.2;
[0028] 依次用透析液A-G透析1次，每次24 + 4;較佳地24 + 2小時。
[0029] 在另一優選例中，透析袋內外液的比例為1:4-6,最佳地為1:5。
[0030] 在另一優選例中，在步驟（1)之前，還包括；利用大腸桿菌，通過IPTG誘導表達重 組人血管內皮細胞生長抑制素包涵體。
[0031] 在本發明的另一方面，提供一種重組人血管內皮細胞生長抑制素的用途，用于制 備與細胞毒性化療藥物或放療療法聯合應用W抑制腫瘤的藥物組合物或藥盒。
[0032] 在一個優選例中，所述的重組人血管內皮細胞生長抑制素是利用前述任一所述的 方法制備的。
[0033] 在本發明的另一方面，提供一種抑制腫瘤的藥盒，所述藥盒包括：
[0034] a)重組人血管內皮細胞生長抑制素；和
[003引 扣）選自下組的化療藥物；順笛或環磯醜胺。
[0036] 在一個優選例中，所述的腫瘤包括；肺癌，肝癌，乳腺癌，黑色素瘤。
[0037] 在另一優選例中，所述的藥盒中，按照重量比，所述的重組人血管內皮細胞生長抑 巧憬與順笛的比例是；3~30:3;較佳地5~15:3;或
[0038] 按照重量比，所述的重組人血管內皮細胞生長抑制素與環磯醜胺的比例是；3~ 30:15;較佳地 5 ~15:15。
[0039] 本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0040] 圖1、rh邸的表達和純化。
[0041]A、SDS-PAGE膠分析。電泳條帶分別是Lanel;預染分子量標記；Lane2 ;His親和柱 純化rh邸蛋白；Lane3JPTG誘導的細菌全菌裂解液；Lane4;未經IPTG誘導表達的細菌全 菌裂解液。
[0042]B、免疫印跡分析。電泳條帶分別是Lanel ;純化的rh邸；Lane2 =IPTG誘導的細菌 全菌裂解液；Lane3 ;未經IPTG誘導的全菌裂解液。
[0043] 圖2、rh邸體外培養對人廝帶血管內皮細胞（HUVEC)的生長抑制作用。
[0044] 圖3、rh邸雞胚尿囊膜血管生成抑制作用。
[0045] 圖4、rh邸單獨用藥對荷瘤小鼠的腫瘤生長抑制作用。
[0046]A、人肺癌A549荷瘤小鼠的用藥效果；
[0047]B、肝癌QGY-7703荷瘤小鼠的用藥效果；
[0048]C、乳腺癌Bcap37荷瘤小鼠的用藥效果。
[0049]圖5、rh邸與傳統細胞毒性化療藥物順笛（A)，環磯醜胺度）對裸鼠肺癌A549 (A) 和黑色素瘤B16度）的協同抗腫瘤作用。
[0050] 圖6、rh邸聯合放療對裸鼠肺癌A549細胞皮下移植瘤的抗腫瘤作用。
【具體實施方式】
[0051] 本發明人經過深入的研究，首次掲示一種新的重組人血管內皮細胞生長抑制素 (riiEndostatin，rhED)包涵體的純化和復性方法。本發明的方法可成本低廉、得率高地獲 得純化的rh邸蛋白，其生物活性優異，藥效顯著。
[005引如本文所用，術語"含有"或"包括"包括了"包含"、"主要由……構成（制成）"、 "基本上由......構成"和"由......構成"。
[0053] 蛋白的表達和純化
[0054] 本發明人嘗試了采用多種表達系統（如酵母系統，大腸桿菌系統）來表達rh邸蛋 白，結果發現大腸桿菌系統可W最為高效地獲得大量rh邸蛋白，且成本低廉，但是表達獲 得的是包涵體形式的蛋白。
[0055] 原核表達系統（如大腸桿菌）W其易于操作、遺傳背景清楚、發酵成本低和蛋白表 達水平高等優點，目前仍然是生產重組蛋白的首選表達系統。但是原核表達的蛋白當高效 表達時一般W包涵體的形式沉積于細胞內，表現為無活性的不溶性聚集物，如何高效地復 性蛋白是基因工程蛋白生產過程中最關鍵和最困難的一步。在大腸桿菌中表達的外源重組 蛋白質包涵體，其蛋白質分子間主要通過非共價作用相互結合在一起，送些非共價作用包 括疏水作用、范德華力、氨鍵W及離子鍵作用。包涵體溶解變性與復性是蛋白純化過程中的 最為關鍵的因素。
[0056] 依巧原核大腸桿菌表達系統從而高效（高產量）表達rh邸是已經實