蛋白質VdAL在提高植物產量和促進植物生長中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域中蛋白質VdAL在提高植物產量和促進植物生長中的應 用。
【背景技術】
[0002] 目前我國大面積糧食及經濟作物的持續高產主要依賴大量使用化肥、防治病蟲害 主要依賴大量噴施化學農藥。中國農業科學院農業經濟與發展研究所研究員胡定梟，在談 及農業污染問題時他指出，我們國家現在還是相當嚴重的，化肥和農藥的過量使用，W及養 殖業中大量使用的抗生素和重金屬添加劑對農業生產都將造成嚴重的污染。
[0003] 據迂寧省統計該省目前化肥年使用量在3萬噸W上，單位面積化肥施用強度約 340千克每公頃，國家生態區建設要求每公頃限值則為每公頃250千克，重氮肥輕憐肥鐘 肥現象普遍不規范施肥問題也較為突出，迂寧省農藥年用量超過1. 4萬噸且呈逐年上升趨 勢。殘留農藥通過大氣沉降和雨水沖刷的形式進入環境和農產品中極易造成環境污染事 件。迂寧省環保廳農村處處長王軍表示近年來隨著農村環境污染問題日漸突出環境信訪案 件呈高發態勢。據統計近兩年迂寧省74個設農縣區環境信訪案件每年平均4310件其中設 農案件近2795件占信訪案件的65%左右。
[0004] 過量施肥會造成農作物吸收營養元素時離子之間增強括抗作用，若某種養分離子 高濃度的存在能夠抑制另一種或多種養分離子的活性，從而影響農作物對另一種營養離子 的吸收。如在酸性±壤里氮肥的施入量過多，作物吸收巧離子就很困難。如果過量地施用 巧肥會誘發農作物的鋒、棚、鐵、儀、儘等微量元素缺乏。鐘肥用量過多也會影響農作物對巧 離子、儀離子的吸收；而且過量施肥易引起農作物中毒，因施入大量肥料，增加了±壤溶液 的濃度，使農作物根系吸收水分困難，造成地上部萎黨，植株枯死。此外，過量施肥還影響農 產品的品質，農作物生長中、后期，如果大量施入化肥，會使農產品器官含糖量降低，不耐膽 藏，從而影響商品價值，降低農作物的經濟效益。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是如何促進植物生長和如何提高植物產量。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明首先提供了蛋白質在提高植物產量和/或調控植物 生長中的應用。
[0007] 本發明所提供的蛋白質在提高植物產量和/或調控植物生長中的應用中，所述蛋 白質的名稱為VdAL為如下Al)或A2)或A3): 陽00引 Al)氨基酸序列為序列1的蛋白質；
[0009] A2)在序列1的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸 殘基得到的具有相同功能的由Al)衍生的蛋白質；
[0010] A3)在Al)或A2)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質。 陽0川其中，序列1由297個氨基酸組成。
[0012] 為了使Al)中的蛋白質便于純化，可在序列表中序列I或序列I的氨基酸所示的 蛋白質的氨基末端或簇基末端連接上如表1所示的標簽。
[001引表l、t不簽的序列
[0014]
陽015] 上述A2)中的VdAL可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上 述A2)中的VdAL的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個 氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或 3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
[0016] 上述VdAL在提高植物產量和/或調控植物生長中的應用中，所述調控植物生長可 為促進植物生長。
[0017] 為解決上述技術問題，本發明還提供了與VdAL相關的生物材料在提高植物產量 和/或調控植物生長中的應用。
[0018] 本發明所提供的與VdAL相關的生物材料在提高植物產量和/或調控植物生長中 的應用；
[0019] 所述生物材料，為下述BI)至B20)中的任一種：
[0020] BI)編碼VdAL的核酸分子；
[0021] B2)含有BI)所述核酸分子的表達盒；
[0022] B3)含有BI)所述核酸分子的重組載體；
[0023] B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；
[0024] B5)含有BI)所述核酸分子的重組微生物； 陽0巧]B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；
[00%] B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0027] B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；
[0028] B9)含有BI)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；
[0029] B10)含有B2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；
[0030] Bl1)含有B3)所述重組載體的轉基因植物細胞系； 陽03UB。）含有B4)所述重組載體的轉基因植物細胞系；
[0032] B13)含有BI)所述核酸分子的轉基因植物組織；
[0033] B14)含有B2)所述表達盒的轉基因植物組織；
[0034]B15)含有B3)所述重組載體的轉基因植物組織；
[0035] B16)含有B4)所述重組載體的轉基因植物組織；
[0036] B17)含有BI)所述核酸分子的轉基因植物器官；
[0037] B18)含有B2)所述表達盒的轉基因植物器官；
[003引B19)含有B3)所述重組載體的轉基因植物器官；
[0039]B20)含有B4)所述重組載體的轉基因植物器官。
[0040] 上述與VdAL相關的生物材料在提高植物產量和/或調控植物生長中的應用中， BI)所述核酸分子可為如下bl)或b2)或b3)的基因：
[0041] bl)核巧酸序列是序列表中序列2的CDNA分子或DNA分子；
[0042]b2)與bl)限定的核巧酸序列具有75%或75%W上同一性，且編碼VdAL的CDNA 分子或基因組DNA分子；
[0043]b3)在嚴格條件下與bl)限定的核巧酸序列雜交，且編碼VdAL的CDNA分子或基因 組DNA分子。 W44] 其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也 可W是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0045] 其中，序列2由894個核巧酸組成，編碼序列1所示的蛋白質。
[0046] 本領域普通技術人員可W很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方 法，對本發明的編碼VdAL的核巧酸序列進行突變。那些經過人工修飾的，具有與本發明分 離得到的VdAL的核巧酸序列75 %或者更高同一性的核巧酸，只要編碼VdAL且具有VdAL功 能，均是衍生于本發明的核巧酸序列并且等同于本發明的序列。
[0047] 運里使用的術語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發明的編碼VdAL所示的氨基酸序列組成的蛋白質的核巧酸序列具有75%或更高，或85% 或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用肉眼或計算機 軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可W用百分比（％)表示， 其可W用來評價相關序列之間的同一性。
[0048] 上述與VdAL相關的生物材料在提高植物產量和/或調控植物生長中的應用中，所 述嚴格條件是在2XSSC，0.1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次5min，又于 0. 5XSSC，0. 1 %SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每次15min;或，0. 1XSS陽（或 0. 1XSSC)、0. 1%SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0049] 上述75%或75%W上同一性，可為80%、85%、90%或95%W上的同一性。
[0050] 上述與VdAL相關的生物材料在提高植物產量和/或調控植物生長中的應用中， B2)所述的含有編碼VdAL的核酸分子的表達盒（VdAL基因表達盒），是指能夠在宿主細胞 中表達VdAL的DNA，該DNA不但可包括啟動VdAL基因轉錄的啟動子，還可包括終止VdAL 基因轉錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。可用于本發明的啟動子 包括但不限于：組成型啟動子，組織、器官和發育特異的啟動子，和誘導型啟動子。啟動子 的例子包括但不限于：花挪菜花葉病毒的組成型啟動子35S:來自西紅柿的創傷誘導型啟 動子，亮氨酸氨基膚酶廣LAP",Chao等人（1999)PlantPhysiol120:979-992);來自煙 草的化學誘導型啟動子，發病機理相關1 (PRl)(由水楊酸和BTH(苯并嚷二挫-7-硫代徑 酸S-甲醋）誘導）；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動子（PIN2)或LAP啟動子（均可用萊莉 酬酸甲醋誘導）；熱休克啟動子（美國專利5,187,267);四環素誘導型啟動子（美國專利 5,057,422);種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子pF128(CN101063139B(中國專 利200710099169. 7))，種子膽存蛋白質特異的啟動子（例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin 和大豆betaconglycin的啟動子度eachy等人（1985化MBOJ.4:3047-3053))。它們可 單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用。此處引用的所有參考文獻均全文引用。合適 的轉錄終止子包括但不限于：農桿菌姻脂堿合成酶終止子（N0S終止子）、花挪菜花葉病 毒CaMV35S終止子、tml終止子、魏豆rbcSE9終止子和姻脂氨酸和章魚氨酸合酶終止 子（參見，例如：〇dell等人（I98S)化Uire313:810;Rosenberg等人（1987)Gene, 56:125 ; Guerineau等人（1991)Mol.Gen.Genet, 262:141 ;P;rou壯oot(1991)Cell, 64:671;Sanfacon 等人GenesDev. ,5:141;Mogen等人（1990)PlantCell, 2:1261 ;Mun;roe等人（1990) Gene, 91:151 ;Ballad等人（1989)NucleicAcidsRes. 17:7891 ;Joshi等人（1987)Nucleic AcidRes. , 15:9627)。
[0051] 可用現有的表達載體構建含有所述VdAL基因表達盒的重組載體。所述植物 表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如PAHC25、地in438、 PCAMBIA1302、PCAMBIA2301、PCAMBIA1301、PCAMBIA1300、PBI121、pCAMBIA1391-Xa或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3'端非翻譯 區域，即包含聚腺巧酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺巧 酸信號可引導聚腺巧酸加入到mRNA前體的3'端，如農桿菌冠瘦瘤誘導（Ti)質粒基因（如 姻脂堿合成酶基因Nos)、植物基因（如大豆膽存蛋白基因）3'端轉錄的非翻譯區均具有類 似功能。使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄 增強子，運些增強子區域可W是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼 序列的閱讀框相同，W保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源 是廣泛的，可W是天然的，也可W是合成的。翻譯起始區域可W來自轉錄起始區域或結構基 因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工， 如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因（GUS基因、蛋光 素酶基因等）、抗生素的標記基因（如賦予對卡那霉素和相關抗生素抗性的nptll基因，賦 予對除草劑麟絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的h地基因，和賦予對氨甲 噪嶺抗性的化化基因，賦予對草甘憐抗性的EPSPS基因）或是抗化學試劑標記基因等（如 抗除莽劑基因）、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-憐酸異構酶基因。從轉基因植物的安全 性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接W逆境篩選轉化植株。
[0052] 上述與VdAL相關的生物材料在提高植物產量和/或調控植物生長中的應用中，所 述載體可為質粒、黏粒、隧菌體或病毒載體。所述質粒可為載體祀T