一種鑭系化合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于體外超微量分析技術領域,尤其涉及一種鑭系化合物及其制備方法和 應用。
【背景技術】
[0002] 于60年代初期創立的標一記免疫分析法是一種將高科技的標記示蹤技術和醫學 免疫學相結合的綜合產物。即利用具備特殊優勢的標一記技術與免疫學中的特有的特異性 反應結合起來的方法技術。此技術具有高度的特異性,此外還具有極其優良的微量分析的 效果。現在該項技術已廣泛應用于疾病的診斷、療效的觀察等重大方面的研究。美國化學 家在研究抗體的過程中發現了一種能測定超微量物質的分析技術,此技術被稱為放射免疫 分析法(radioimmunoassay, RIA),即利用特異性抗體與標一記后的抗原競爭免疫反應后, 然后測定放射性復合物來得出非標一記抗原量的方法。此技術常使用具有放射性的碘元素 來作為標記物標記抗體或抗原,結果顯示放射免疫分析具有高度的靈敏性以及非常穩定的 信號等其它優點。但其在分析系統中應用時存在放射性污染的危險性,對放射性廢棄物的 處理相當麻煩。此外放射性的同位素不穩定,使得該分析方法受到了極大的限制,因此找到 一種能夠替代放射性的標一記物變得至關重要。
[0003] 酶標記的免疫分析法(enzyme immunoassay, EIA)是從1966年開始應用,這種分 析法是使用酶分子代替非特異性標記的抗體或抗原分子,這種技術是一種競爭性或者非競 爭性的關于免疫分析的核心技術。原理與放射免疫分析基本相同,但EIA是將酶分子結合 在抗體上。將反應結合后的復合物與游離的抗體分離開,反應的結合部分利用酶的催化活 性,將特定的底物轉化為特殊的顏色的時候,應用紫外分光光度計檢測含量,在這里酶的顏 色與其濃度以及反應結合后形成的物質的含量均呈正比例的關系,從而可計算出結合后的 目標產物的含量。檢測過程中并不需要使用能發出有用的核心信號的化合物,因在反應過 程后便能生成可產生用來檢測信號的物質,所以很有希望使得酶標記法變成一種可替代放 射免疫分析的技術。不會發生信號的基質利用酶的催化效果能夠產生顯色或者發光的反 應,反應產物的含量與酶含量是線性的比例關系。因而蛋白質的濃度可以利用此方法測量 酶催化后的產物的含量便可得到。但總的來說,該法測定所用酶的活性極易受到溫度,PH以 及溶液中各種離子濃度的影響,使得此法測定靈敏度和精密度大多情況下不如放射免疫分 析法。時間分辨焚光免疫分析法(time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)是1978年 由weider研究開發出來的一種新型的分析方法。因其能夠大幅提升熒光免疫分析的靈敏 度,故二十幾年來得到了迅猛的發展。由于銅系元素可發射出熒光,用它來和鰲合物結合后 一同作為標一記物從而與時間分辨免疫熒光法結合的一項新技術首先被Kojala和Soini 發現,并隨后創建成了一種新的分析技術。TRFIA技術替代了以酶標記為主的酶聯免疫分析 法和以放射性同位素標記為主的放射免疫分析法。銅系離子可接受較寬范圍的激發光而且 其發射出的光譜范圍也窄,這樣使得斕系離子具有比較大的Stokes位移,摒棄了非特異性 熒光的干擾。稀土離子標記的鰲合劑能發射出時間長以及高強度的熒光,這樣就降低了待 測樣品中的短壽命熒光的影響,使得靈敏度得到了很大程度上的提高。此類標記物是一種 可以與抗體或抗原相結合,又能被相應的儀器所檢測到的物質。在免疫分析中應用的標記 物與抗原或者抗體的活性部位基團結合后的化學性質不會發生根本性的變化,而且被標記 的抗原或抗體的物理性質及化學性質也不會發生實質性的改變。非特異性熒光的干擾在檢 測時被有效的排除是由于稀土離子標記的鰲合物具有Stokes位移大的優點,同時熒光信 號的特異性也得到了增強。被稀土標記的鰲合物能夠穩定保存的期限可達兩年。
[0004] TRFIA采用鑭系元素及其螯合劑作為示蹤物,代替同位素。標記抗原、抗體、多肽、 生物活性細胞或核酸探針,待反應體系中的抗原抗體形成免疫復合物,或發生生物親和素 反應、核酸探針雜交反應后,利用時間分辨熒光測定儀測定該體系的熒光強度,從而確定 待分析物的含量。TRFIA技術繼承了鑭系元素螯合物的固有特點:(1)與普通熒光比較, 鑭系離子螯合物的熒光衰變時間更長,大約103-106 ns,為普通熒光衰變時間的103-106 倍;(2)激發光與發射光的Stokes位移大,最高可達278 nm,而普通焚光的Stokes位移只 有幾十納米。利用鑭系稀土離子衰變時間長的特點,在每個激發光脈沖過后,通過時間延 緩期,讓短壽命的熒光衰變掉后,再打開取樣門,記錄稀土螯合物的熒光強度,幾乎可以完 全消除背景熒光的干擾,提高靈敏度。自20世紀80年代TRFIA問世以來,TRFIA已開發 出4種主要的分析系統:解離增強鑭系元素熒光分析系統、FIAgen分析系統、酶放大TRFA (time-resolved fl uorescenceassay)系統、均相TRFA系統。這4種分析系統的主要區別 在于使用了不同的螯合物,在液相或固相下實現對熒光的測定。有研究者從技術理論、反應 體系等方面進一步改進與完善TRFIA,提出了基于FRET理論的時間分辨猝滅分析技術等。
[0005] TRFIA技術優點突出,隨著研究的深入,應用日益廣泛。TRFIA技術已在國際超微 量分析技術領域展示了巨大的應用前景。但都面臨著一些共同亟待解決的問題:急需開 發一種新型的雙功能螯合劑,FIAgen分析系統、解離增強鑭系元素熒光分析系統、酶放大 TRFA系統、均相TRFA系統等。
【發明內容】
[0006] 解決的技術問題:針對新型雙功能螯合劑的缺失極大地限制了 TRFIA技術的推廣 的缺點,本發明提供一種鑭系化合物及其制備方法和應用。
[0007] 技術方案:一種鑭系化合物,該鑭系化合物的化學結構式為:
[0008] 上述所述的一種鑭系化合物的制備方法,該方法包括以下步驟: (1)化合物A2合成: 將化合物AU吡啶鹽、乙酸銨和無水甲醇混合后,回流12h,抽濾,固體用無水甲醇洗滌 后烘干,得到白色產物,烘干即得化合物A2,其中化合物Al是(1E,5E)-1.6 -二(2 -呋喃 基)-1,5-己二烯-3, 4-二酮; (2) 化合物A3的合成: 將化合物A2、高錳酸鉀依次加入叔丁醇溶液中,攪拌回流7h,冷卻至室溫后,用鹽酸 調節PH值至2,析出的固體抽濾后用冰甲醇洗滌,得到棕色或黃色產物,烘干,即得化合物 A3 ; (3) 化合物A4的合成: 將化合物A3溶解于甲醇溶液中,在室溫下滴加濃硫酸至溶液呈半渾濁狀態,加熱回流 8h,再冷卻至室溫,析出針狀形的晶體,即為化合物A4 ; (4) 化合物A5的合成: 將化合物A4、NBS在CCl4中回流30min后,加入BPO,繼續回流2h,得到白色沉淀產物 ,過濾后即得化合物A5; (5) 化合物A6的合成: 將化合物A5溶解于甲醇中,然后將1,3, 5, 7-四氮雜三環[3. 3. 1. 13]癸烷加入其中, 將反應液加熱回流12h,冷卻至室溫后,將有機層干燥濃縮后進行柱層析,得到的組分進行 重結晶,制得白色固體,即為化合物A6 ; (6) 化合物A7的合成: 將化合物A5加入HPLC級別的乙腈中,再加入化合物A6和無水碳酸鈉,在氬氣保護下 加熱回流24h,然后將溶液冷卻至室溫,過濾,濾液旋干,再加入三氯甲烷溶解,濾液旋干,再 加入乙酸乙酯,加熱至溫度為50°C,趁熱過濾,再將固體抽干,即得化合物A7 ; (7) 化合物A8的合成: 將EuCl^入無水乙腈中,回流30min,然后加入化合物A7,繼續回流5h,冷卻至室溫后 過濾,得到的固體即為化合物A8 ; (8) 化合物A9的合成: 將化合物A8溶于甲醇中,然后用30min滴加乙二胺,用甲醇稀釋,繼續攪拌4-5h,再把 清液濃縮,繼續用40min滴加乙二胺,用甲醇稀釋,繼續攪拌4h,再將清液抽干,然后加入去 離子水,離心,去掉上層液,固體繼續用去離子水洗滌兩次,再離心,最后抽干固體,即得化 合物A9 ; (9) 鑭系化合物的合成: 將化合物A9溶于甲醇,然后加入I mol/L的LiOH水溶液,室溫下攪拌6h后,將渾濁 液離心,去除甲醇溶液,再將固體抽干,往固體中加入濃度為1