一種免標記熒光探針及其在檢測雙倍體g-四鏈體結構中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一類新型免標記熒光探針，以及其在細胞內外熒光檢測雙倍體G-四 鏈體核酸二級結構中的應用。
【背景技術】
[0002] G-四鏈體（G-quadruplex)是一種特殊的DNA二級結構。人類基因組中很多富含 鳥嘌呤（G)區域具有形成這一結構的能力，包括端粒末端鳥嘌呤重復序列，以及多種基因的 啟動子區域，如c-kil^c-myc^c-mytKbclUDGFARASJEGF、!^)和胰島素基因等。最新研 究表明，很多非編碼區的RNA序列也可以形成G-四鏈體結構，RNA的G-四鏈體結構比DNA 更穩定，該結構可能通過阻止基因的翻譯或參與蛋白結合識別的過程而達到抑制腫瘤生長 的效果。G-四鏈體結構的形成對于體內的一系列生理過程都存在調控作用。研究證明，某 些啟動子區域的G-四鏈體結構會顯著影響基因的轉錄和翻譯水平，因此G-四鏈體結構被 認為是起到分子開關的功能，其形成和拆散可能涉及到信號傳導、細胞凋亡和細胞增殖等 一系列體內重要的生理過程。所以，在體內或者體外試驗中，能夠特異性地檢測出G-四鏈 體結構的存在或者形成，對于研究G-四鏈體結構的相關生物學功能以及開發以G-四鏈體 結構為靶點的抗癌藥物等方面都具有非常重要的作用。
[0003] 目前，在體內和體外檢測G-四鏈體結構的研究都取得了一些進展。由于體內大大 過量的雙螺旋DNA的存在，以及復雜的細胞內環境，使得體內的檢測相對于體外檢測需要 解決更多的難題，目前已有一些熒光分子可以實現體內G-四鏈體結構的檢測；體外實驗中 檢測G-四鏈體結構主要是通過儀器的手段，比如圓二色譜法、核磁共振、表面等離子共振、 熒光共振能量轉移等方法，這些方法對儀器和技術操作的要求都較高，而且價格較昂貴，基 本上不能普及使用。并且，目前大多數研究興趣集中于對某一構象(如平行、反平行或混合 性）的單倍體G-四鏈體結構的選擇性和靈敏度檢測，同時一個優良的熒光探針在檢測靶向 G-四鏈體的同時，不能影響靶向分子的構象和熱穩定性，然而這樣的熒光分子報道很少。
[0004] 人端粒DNA是染色體末端由DNA重復序列TTAGGG組成的雙螺旋區，其末端是含有 100-200 nt核苷酸的富含G堿基的單鏈懸突，該端粒DNA懸突為端粒酶的底物，端粒酶的激 活和端粒的延長將導致腫瘤的發生。而這些富G的單鏈懸突，在一定的條件下可以形成復 雜的由TTA堿基對序列連接的雙倍體或者多倍體G-四鏈體結構，通過一些熒光分子實現對 雙倍體或者多倍體G-四鏈體結構的檢測，對研究G-四鏈體結構的相關生物學功能以及開 發以G-四鏈體結構為靶點的抗癌藥物等方面都具有重要的作用。而目前對雙倍體或多倍 體G-四鏈體的熒光檢測尚處于起步階段，報道的熒光分子不多。
[0005] 目前，只有文獻報道單個的表小檗堿能夠熒光檢測存在于K+溶液中的混合型單倍 體和多倍體G-四鏈體，且該熒光分子無法區分單倍體和多倍體G-四鏈體。
【發明內容】
[0006] 針對雙倍體G-四鏈體檢測方面的空白，本發明提供了一類免標記的熒光探針，可 在溶液中區分單倍體和多倍體G-四鏈體；并且還能夠檢測出細胞中的G-四鏈體。本發明 探針不僅具有高靈敏度和選擇性識別，且不影響G-四鏈體結構構象和熱穩定性。
[0007] 本發明目的在于提供醚鏈連接的對稱小檗堿二聚體衍生物作為G-四鏈體結構檢 測探針的應用。
[0008] 本發明所采取的技術方案是： 醚鏈連接的對稱小檗堿二聚體衍生物，其分子結構如式I所示：
,其中η為2或3。
[0009] 上述醚鏈連接的對稱小檗堿二聚體衍生物作為G-四鏈體結構檢測探針的應用。 [0010] 進一步的，上述G-四鏈體DNA結構為雙倍體G-四鏈體結構。
[0011] 進一步的，上述的雙倍體G-四鏈體結構為5' -A(GGGT TA)7G3-3'或 5' -A(GGGTTA)4(TTA GGG)4-3'序列構成的雙倍體G-四鏈體結構。
[0012] 上述的醚鏈連接的對稱小檗堿二聚體衍生物檢測雙倍體G-四鏈體結構的方法， 其該方法為將待測DNA溶液中加入醚鏈連接的對稱小檗堿二聚體衍生物溶液，混勻，檢測 混合液的熒光強度，若待測DNA溶液的熒光強度增強了至少160倍，說明待測DNA中含有雙 倍體G-四鏈體結構。
[0013] 進一步的，上述待測DNA溶液的溶劑為含Na+的pH 6. 0~8. 0的Tris-HCl緩沖 液。
[0014] 進一步的，上述醚鏈連接的對稱小檗堿二聚體衍生物溶液的溶劑為含Na+的pH 6. 0~8. 0的Tris-HCl緩沖液。
[0015] 進一步的，上述待測DNA與醚鏈連接的對稱小檗堿二聚體衍生物的摩爾比為 (1~10) ：1〇
[0016] 上述醚鏈連接的對稱小檗堿二聚體衍生物檢測雙倍體G-四鏈體結構的方法，包 括以下步驟： 1) 測定待測DNA溶液中DNA的濃度； 2) 往待測DNA溶液中加入醚鏈連接的對稱小檗堿二聚體衍生物，混勻，檢測混合液的 熒光強度； 3) 將上步測得的熒光強度和所述衍生物檢測雙倍體G-四鏈體結構的標準熒光光譜進 行比對，即可判斷待測DNA中是否含有雙倍體G-四鏈體結構，并確定具體含有哪種雙倍體 G-四鏈體結構。
[0017] 上述醚鏈連接的對稱小檗堿二聚體衍生物檢測細胞中G-四鏈體結構的方法，該 方法為將細胞與所述衍生物共孵2. 5~3. 5 h后，在熒光顯微鏡下對細胞進行熒光檢測，若細 胞產生明顯的熒光，說明細胞中含有G-四鏈體結構。
[0018] 本發明的有益效果是： I)本發明探針穩定，易得，并且結構穩定，便于儲存。
[0019] 2)本發明提供的探針可以特異性地結合雙倍體G-四鏈體結構，可實現對雙倍體 G-四鏈體結構與其他核酸結構的區分；本發明只需用簡單紫外燈或者熒光光譜就可以識 別出DNA二級結構G-四鏈體結構，快捷，操作簡單，成本低廉。
[0020] 3)本發明探針免標記熒光檢測雙倍體G-四鏈體，不影響其構象和熱穩定性。
[0021] 4)本發明探針1對雙倍體G-四鏈體G2T1的檢測靈敏度為0. 65 nM，探針2對雙 倍體G-四鏈體G2T2的檢測靈敏度可達I. 6 nM。
[0022] 5)本發明探針可以進入細胞，可對細胞中的G-四鏈體結構進行檢測，使得此類探 針具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0023] 圖1為探針1對不同構型DNA在紫外燈下的發光情況及熒光強度柱狀圖； 圖2為探針1加入不同濃度不同構型DNA時在530 nm的熒光強度變化圖； 圖3為單倍體G-四鏈體Gl滴定探針1的熒光光譜圖；（a)單倍體Gl滴定探針1 (0. 5 μ M)的熒光光譜；（b)探針1 (0.5 μ M)的熒光強度與單倍體Gl濃度的線性圖。實驗條 件：10 mM Tris-HCl buffer, 100 mM NaCl, pH 7. 2. λ ex/λ en = 355/530 nm ; 圖4為雙倍體G-四鏈體G2T1滴定探針I的熒光光譜；（a)探針I滴定雙倍體G2T1的 熒光光譜；（b)探針1 (0.5 μ M)的熒光強度與雙倍體G2T1濃度的線性圖。實驗條件： 10 mM Tris-HCl buffer, 100 mM NaCl, pH 7. 2. λ ex/λ en = 355/530 nm ; 圖5為雙倍體G-四鏈體G2T2滴定探針I的熒光光譜；（a)探針I滴定雙倍體G2T2的 熒光光譜；（b)探針1 (0.5 μ M)的熒光強度與雙倍體G2T2濃度的線性圖。實驗條件： 10 mM Tris-HCl buffer, 100 mM NaCl, pH 7. 2. λ ex/λ en = 355/530 nm ; 圖6為探針I (0.5 μ M)對不同濃度（0~0· 5 μ M)的Gl (a)和G2T1 (b)的靈敏度檢 測圖； 圖7為單倍體G-四鏈體Gl和雙倍體G-四鏈體G2T1在存在探針1時的CD譜； 圖8為他1&癌細胞在人6：; = 488 11111處不含（&、(1和8)和含（13、6和11)探針1(5以1) 反應3 h時的共聚焦熒光細胞成像圖，及其疊加圖（c、f和i)。圖a~c、d~f和g~i分 別代表空白癌細胞（Control)、加了 DNA消化酶的癌細胞（DNase)和加了 RNA消化酶的癌細 胞（RNase); 圖9為探針2對不同構型DNA在紫外燈下的發光情況及熒光強度柱狀圖； 圖10為單倍體G-四鏈體Gl滴定探針2的熒光光譜圖；(a)探針2滴定單倍體Gl的 熒光光譜；（b)探針2 (0.5 μ M)的熒光強度與單倍體Gl濃度的線性圖。實驗條件：10 mM Tris-HCl 緩沖溶液，100 mM NaCl, pH 7· 2· λ ex/λ en =