Sclerotiorin衍生物及其制備方法與作為抗甲型H1N1流感病毒劑的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種Sclerotiorin衍生物及其制備方法與應用，特別是涉及一種對 甲型HlNl流感病毒具有極強的抑制活性的Sclerotiorin衍生物及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 甲型HlNl流感病毒是A型流感病毒，攜帶有HlNl亞型豬流感病毒毒株，包含有禽 流感、豬流感和人流感三種流感病毒的核糖核酸基因片斷，同時擁有亞洲豬流感和非洲豬 流感病毒特征。自2009年3月18日在墨西哥爆發甲型HlNl流感病毒以來，已經陸續發現 感染、死亡病例。因此，尋找安全高效的抗甲型HlNl流感病毒劑成為國際上急需解決的課 題。海洋天然產物被認為是新型抗病毒劑的重要來源。海洋微生物由于在實驗室中可以 大規模發酵，不易破壞自然環境，而成為活性海洋化合物的最重要來源。然而，近年來尚未 見到直接從海洋微生物中來源的天然化合物或其衍生物作為抗甲型HlNl流感病毒劑的應 用。
[0003] (Centers for Disease Control and Prevention. Update ：novel influenza A(HlNl)virus infections-worldwide, May 6,2009.MMffR Morb Mortal Wkly Rep. 2009, 58,453_458;Scalera，N.M. ;Mossad，S.B. Postgrad Med. 2009，121，43_47 ;Medina，R. A.; Garcia-Sastre，A. Nat. Rev. Microbiol. 2011，9, 590-603.) D
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種來源于海洋真菌的Sclerotiorin衍生物的制備方法 與作為抗甲型HlNl流感病毒劑的應用，它能滿足現有技術的上述需求。菌種保藏信息：保 藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址：北京市朝 陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；保藏日期：2014年4月3日；保藏編 號：CGMCC No. 8994 ;分類命名：Penicillium sp. 〇
[0005] 本發明提供式I化合物或其藥學上可接受的鹽：
或其藥學上可接受的鹽。式I中R為
本發明提供式I化合物的制備方法，其特征在于先在菌 種培養基中對分離自柳珊瑚的內生真菌Penicillium sp. (TA33-1)進行菌種培養，再在發 酵培養基中對該真菌進行發酵培養，將所得菌絲體用氯仿-甲醇混合液（I : 1)浸提3次 減壓濃縮后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏分別進行正相硅膠柱層析、 S印hadex LH-20凝膠柱層析后，再經HPLC高效液相制備色譜，將所得洗脫液濃縮，得黃色 粉末，即為（+)-Sclerotiorin ;在溶有（+)-Sclerotiorin的二氯甲燒溶液中，加入有機伯 胺和碳酸鉀，反應后得到式I化合物。
[0007] 上述制備方法中菌種培養基優選含有葡萄糖0. 1 %-5.0% (重量百分比，下 同）、酵母膏 0.01 % -1 %、蛋白胨 0.01 % -1 %、瓊脂 〇· 1% -3.0%、氯化鈉 0.05% -5%， 其余為水，培養溫度優選為0-30 °C，培養時間優選為3-15天；發酵培養基優選含有 大米1.0% -80. 0% (重量百分比，下同）、氯化鈉0.05% -5%，其余為水，培養溫度 優選為0-30°C，培養時間優選為10-60天；所述的正相硅膠柱層析采用的固定相 優選200-300目硅膠，流動相優選體積比為15 % -60 %的乙酸乙酯-石油醚混合溶 劑；所述Sephadex LH-20凝膠柱層析采用的流動相優選體積比為石油醚：氯仿： 甲醇=2 : I : 1的混合溶劑；所述HPLC高效液相制備色譜中采用的色譜柱為本 領域常規ODS C18柱，優選為Kromasil 10 X 250_，5 μ m，流速優選為1. 0-5. OmL/ min，流動相優選體積比為50% -80 %的甲醇-水混合溶劑；所述的有機伯胺為
[0008] 本發明從海洋真菌中獲得的Sclerotiorin衍生物對甲型HlNl流感病毒具有極強 的抑制活性，可用于開發抗甲型HlNl流感病毒劑，應用前景廣闊。
[0009] 本發明的另一實施方案提供式I化合物或其藥學上可接受的鹽在制備抗甲型 HlNl流感病毒劑中的應用。
[0010] 本發明中術語"藥學上可接受的鹽"是指非毒性的無機或有機酸和/或堿的加成 鹽。可參見"Salt selection for basic drugs"，Int. J.Pharm. (1986)，33,201_217〇
【具體實施方式】 toon] 為了便于對本發明的進一步理解，下面提供的實施例對其做了更詳細的說明。但 是這些實施例僅供更好的理解發明而并非用來限定本發明的范圍或實施原則，本發明的實 施方式不限于以下內容。
[0012] 實施例1
[0013] (1)柳珊瑚內生真菌Penicillium sp. (TA33-1)的菌種培養
[0014] 菌種培養所用的培養基含有葡萄糖1. 0% (重量百分比，下同）、酵母膏0. 2%、蛋 白胨0. 2 %、瓊脂I. 0 %、氯化鈉3. 0 %，其余為水，使用時制成試管斜面，真菌菌株在30°C下 培養3天。
[0015] ⑵柳珊瑚內生真菌Penicillium sp. (TA33_1)的發酵
[0016] 發酵培養所用的培養基含有大米40. 0 % (重量百分比，下同）、氯化鈉3. 0 %，其余 為水；真菌菌株于28°C培養30天。
[0017] (3) (+)-Sclerotiorin 的提取分離
[0018] 取60瓶步驟（2)得到的菌絲體，用氯仿-甲醇混合液（I : 1)浸提3次減壓濃縮 后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏分別進行正相硅膠柱層析（固定相為 200-300目硅膠；流動相為30%乙酸乙酯/石油醚混合溶劑，體積比）、5印1^(1^1^-20凝 膠柱層析（石油醚：氯仿：甲醇=2 : I : 1的混合溶劑，體積比）后，再經HPLC高效液 相制備色譜分離（色譜柱為Kromasil 10X250mm，5 μπι，流速為2. OmL/min，流動相為65% 的甲醇-水混合溶劑，體積比），將所得洗脫液濃縮，得黃色粉末，即為（+)-Sclerotiorin。
[0019] 實施例2
[0020] (1)柳珊瑚內生真菌Penicillium sp. (TA33-1)的菌種培養
[0021] 菌種培養所用的培養基含有葡萄糖0. 1% -5. 0% (重量百分比，下同）、酵母膏 0. 01% -1%、蛋白胨0.01% -1%、瓊脂0. 1% -3.0%、氯化鈉0.05% -5%，其余為水，使用 時制成試管斜面，真菌菌株在0_30°C下培養3-15天。
[0022] (2)柳珊瑚內生真菌 Penicillium sp. (TA33-1)的發酵
[0023] 發酵培養所用的培養基含有大米I. 0 % -80. 0 % (重量百分比，下同）、氯化鈉 0. 05% -5%，其余為水，真菌菌株于0-30°C培養10-60天。
[0024] (3) (+)-Sclerotiorin 化合物的提取分離
[0025] 取10-300瓶步驟（2)所得的將所得菌絲體用氯仿-甲醇混合液（I : 1)浸提3 次減壓濃縮后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏濃縮后分別進行正相硅 膠柱層析（固定相為本領域常規正相硅膠，流動相為15% -40%的乙酸乙酯-石油醚混合 溶劑，體積比）、Sephadex LH-20凝膠柱層析（流動相為石油醚：氯仿：甲醇=2 : I : 1 的混合溶劑，體積比）后，再經HPLC高效液相制備色譜（色譜柱為本領域常規ODS C18柱， 流速為I. 0-5. OmL/min，流動相為50 % -80 %的甲醇-水混合溶劑，體積比），將所得洗脫液 濃縮，得黃色粉末固體，即為（+)-Sclerotiorin化合物。
[0026] 實施例1-2中未具體指明的其他菌種培養、發酵條件，以及正相硅膠柱色譜分離、 Sephadex LH-20凝膠柱層析分離、高效液相色譜分離等其他實驗操作條件均為本領域常規 的實驗操作條件，本領域的技術人員可以根據實際需要，進行合理的選擇。
[0027] 實施例3
[0028] 稱取上述干燥后的（+)-Sclerotiorin (0· Imol)溶解在二氯甲烷中，常溫條件下， 在充分攪拌下將有機伯胺（〇. 12mol)逐滴滴加到反應溶液中，反應1小時后，向反應物中加 入蒸餾水（200mL)來終止反應，用乙酸乙酯（500mL)進行萃取，將萃取液濃縮后，進行柱層 析，用乙酸乙酯洗脫，洗脫液濃縮，重結晶后得到式I化合物。
[0029] 實施例3中未具體指明的其他有機化學反應條件，以及正相硅膠柱色譜分離等其 他實驗操作條件均為本領域常規的實驗操作條件，本領域的技術人員可以根據實際需要， 進行合理的選擇。
[0030] 式I化合物的具體化合物結構實例：
[0031]
[0032] 式I化合物的結構確證數據：
[0033] I :? NMR(600MHz，CDC13) δΗ 7.84(lH，s，H-l)，7. 16(lH，s，H-4)，6.98(lH，d，J = 15. 6Hz, H-10), 6. 58 (1H, t, J = 2. 4Hz), 6. 41 (2H, d, J = I. 8Hz), 5. 70 (1H, d, J = 15. 6Hz, H-9)，5. 68 (1H，d，J = 9. 6Hz，H-12)，3. 83 (6H，s)，2. 42 (1H，m，H-13)，2. 18 (3H，s，H-20)， I. 59 (3H，s，H-17)，I. 57 (3H，s，H-18)，I. 42 (1H，m，H-14)，I. 32 (1H，m，H-14)，I. 00 (3H，d， J = 6. 6Hz，H-16)，0· 85(3H，t，J = 7. 2Hz，H-15). 13C NMR(150MHz，CDCl3) δ c 193. 9(C-6)， 184. 7 (C-8)，170. 3 (COCH3)，161. 8,161. 8,147. 9 (C-I)，147. 4,144. 2,143. 2,141. 8,141. 1， 132. O(C-Il)，116. 2(C-9)，114. 3(C-5)，109. 6,109. 6,109. 6,103. 3(C-8a)，101. 8(C-4)， 84. 9 (C-7)，56. 0 (-OCH3)，55. 9 (-OCH3)，35. I (C-13)，30.1 (C-14)，23. 3 (C-18)，20. 4 (C-16)， 20. 3(C0CH3),12. 5(C-17),12. l(C-15).ESIMSm/z 526. 05/528. 05[M+H]7[M+H+2]+ (3 ： I), 547. 99/550. 01[M+Na]+/[M+Na+2] + (3 ： I), 1072. 84/1072. 77[2M+Na]7[2M+Na+2]+ (3 ： I). HRESIMSm/z526. 1981 [M+H]+ (calcd for C29H33O6NCl, 526. 1991).
[0034] 2 :? NMR(600MHz，CDC13) δΗ 7.85(lH，s，H-l)，7. 16(lH，s，H-4)，6.99(lH，d，J = 15. 6Hz，H-10)，6. 50 (2H，s)，5. 68 (2H，overlapped，H-9and H-12)，3. 91 (3H，s)，3. 87 (6H， s)，2. 42 (1H，m，H-13)，2. 19 (3H，s，H-20)，I. 59 (3H，s，H-17)，I. 57 (3H，s，H-18)，I. 42 (1H，m， H-14)，L32(lH，m，H-14)，1.00(3H，d，J = 6.6Hz，H-16)，0.85(3H，t，J = 7.2Hz，H-15).13C 匪R(150MHz，CDCl3) δ c 193. 9 (C-6)，184. 7 (C-8)，170. 4 (COC