針對組織因子途徑抑制劑的前體藥物抗體的制作方法
【專利說明】
[0001] 背景 根據37 C.F.R. 1.821 (C)，隨同提交作為ASCII標準文本文件的序列表，所述ASCII 標準文本文件命名為"BAYRP0004W0_ST25.txt"，于2014年3月14日創建，并且具有~312 千字節的大小。前述文件的內容在此整體引入作為參考。
[0002] 本申請要求于2013年3月15提交的美國臨時申請序列號61/794, 024的優先權 利益，所述美國臨時申請的完整內容在此引入作為參考。
[0003] I.技術領域
技術領域涉及血友病及其他凝血病的治療。
[0004] II.相關技術 血液凝固是通過其血液形成穩定血塊以止血的過程。該過程涉及在血液中循環的許多 酶原和促輔因子（procofactor)(或"凝血因子")。這些酶原和前輔因子通過幾種途徑相互 作用，它們通過所述途徑相繼或同時轉換為活化形式。最終，該過程導致在因子Va、離子鈣 和血小板的存在下，凝血酶原通過活化因子X (FXa)活化為凝血酶。活化凝血酶進而誘導 血小板聚集，并且將纖維蛋白原轉換成纖維蛋白，其隨后通過活化因子XIII (FXIIIa)交聯 以形成血塊。
[0005] 導致因子X活化的過程可以通過兩個不同途徑進行：接觸活化途徑（以前稱為內 源性途徑）和組織因子途徑（以前稱為外源性途徑)。先前認為凝血級聯由與共同途徑連接 的具有相等重要性的兩個途徑組成。目前已知用于起始血液凝固的主要途徑是組織因子途 徑。因子X可以被與活化因子VII (FVIIa)組合的組織因子（TF)活化。因子Vila及其必 需輔因子TF的復合物是凝血級聯的有力引發劑。
[0006] 凝血的組織因子途徑受組織因子途徑抑制劑（〃TFPI〃）負面控制。TFPI是FVIIa/ TF復合物的天然FXa依賴性反饋抑制劑。它是多價Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑的成員。 生理學上，TFPI與活化因子X (FXa)結合，以形成異二聚復合物，其隨后與FVIIa/TF復合 物相互作用，以抑制其活性，因此關閉凝血的組織因子途徑。原則上，阻斷TFPI活性可以恢 復FXa和FVIIa/TF活性，因此延長組織因子途徑的作用持續時間且擴大FXa的生成，所述 FXa是血友病A和B中的共同缺陷。
[0007] 事實上，一些初步實驗證據已指示通過針對TFPI的抗體阻斷TFPI活性使延長的 凝血時間標準化或縮短出血時間。例如，Nordfang等人顯示在用針對TFPI的抗體處理血 衆后，血友病血衆的延長稀釋凝血酶原時間被標準化//aewosi·，1991，66 (4): 464-467)。類似地，Erhardtsen等人顯示血友病A兔模型中的出血時間被抗TFPI抗體顯 著縮短（扮ooi/ 388-394)。這些研究提不通過抗 TFPI抗體抑制TFPI可以用于治療血友病A或B。僅多克隆抗TFPI抗體用于這些研究中。
[0008] 使用雜交瘤技術，制備且鑒定針對重組人TFPKrhTFPI)的單克隆抗體。參見Yang 等人，Oi/?. ifeoi ^，1998,111(8): 718-721。測試單克隆抗體對稀釋凝血酶原時間（PT) 和活化部分促凝血酶原時間（APTT)的作用。實驗顯示抗TFPI單克隆抗體縮短因子IX缺 乏血漿的稀釋凝血酶凝血時間。提示組織因子途徑不僅在生理學凝血中，還在血友病的出 血中起重要作用（Yang 等人，及《a/? /i 心 /? Λ/e Λ/e 你〇，1997,22 (4) : 297-300)。
[0009] 授予Kjalke等人的美國專利號7, 015, 194公開了包含FVIIa和TFPI抑制劑的組 合物，所述TFPI抑制劑包括多克隆或單克隆抗體或其片段，用于治療或預防出血發作或凝 血治療。還公開了此類組合物降低正常哺乳動物血漿中的凝血時間的用途。進一步提出因 子VIII或其變體可以包括在公開的FVIIa和TFPI抑制劑的組合物中。未提出FVIII或因 子IX與TFPI單克隆抗體的組合。除用于血友病的治療之外，還已提出TFPI抑制劑包括多 克隆或單克隆抗體可以用于癌癥治療(參見授予Hung的美國專利號5, 902, 582)。
[0010] 相應地，需要對于TFPI特異性的改善抗體用于治療血液學疾病和癌癥。
[0011] 公開內容概述 因此，依照本公開內容，提供了包含下述的抗體：（a)含有第一輕鏈可變區和第一重鏈 可變區的第一可變結構域，所述第一可變結構域與組織因子途徑抑制劑（TFPI)免疫學結 合；（b)與第一輕鏈可變區和/或第一重鏈可變區的氨基末端連接的掩蔽結構域；和（C)介 于第一輕鏈可變區和/或第一重鏈可變區和掩蔽結構域之間的蛋白酶可切割接頭。蛋白酶 可切割結構域可以是凝血酶、纖溶酶、因子Vila或因子Xa切割位點。掩蔽結構域可以包含 第二可變結構域，其包含第二輕鏈可變區和第二重鏈可變區。抗體可以是IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4、IgM、IgAU IgA2、分泌型IgA、IgD和IgE抗體。抗體可以是人或人源化抗體，和/或 單鏈抗體。抗體可以是：二價的且包含兩個掩蔽結構域，一個連接至每個第一輕鏈可變區的 氨基末端；或二價的且包含兩個掩蔽結構域，一個連接至每個第一重鏈可變區的氨基末端； 或二價的且包含四個掩蔽結構域，一個連接至每個第一輕鏈可變區和每個第一重鏈可變區 的氨基末端，例如其中掩蔽結構域中的兩個是第二輕鏈可變區，并且掩蔽結構域中的兩個 是第二重鏈可變區，其中第二輕鏈可變區和第二重鏈可變區形成第二可變結構域。第二可 變結構域可以與組織因子（TF)、紅細胞或白蛋白結合。掩蔽結構域可以是白蛋白結合蛋白。 抗體可以與人組織因子途徑抑制劑的Kunitz結構域2結合。
[0012] 還提供的是包含處于啟動子的控制下的關于如上所述的抗體的編碼區的表達載 體，以及包含此類表達載體的細胞。還提供的是包含用藥學可接受的緩沖液、載體或稀釋劑 配制的如上所述的抗體的藥物制劑。
[0013] 在另一個實施方案中，提供的是治療對象中的凝血障礙的方法，其包括以有效促 進對象中的凝血的量給對象施用包含下述的抗體：（a)含有第一輕鏈可變區和第一重鏈可 變區的第一可變結構域，所述第一可變結構域與組織因子途徑抑制劑（TFPI)免疫學結合； (b)與第一輕鏈可變區和/或第一重鏈可變區的氨基末端連接的掩蔽結構域；和（C)介于 第一輕鏈可變區和/或第一重鏈可變區和掩蔽結構域之間的蛋白酶可切割接頭。蛋白酶可 切割結構域可以是凝血酶、纖溶酶、因子Vila或因子Xa切割位點。掩蔽結構域可以包含第 二可變結構域，其包含第二輕鏈可變區和第二重鏈可變區。抗體可以是IgGU IgG2、IgG3、 IgG4、IgM、IgAU IgA2、分泌型IgA、IgD和IgE抗體。抗體可以是人或人源化抗體，和/或 單鏈抗體。抗體可以是：二價的且包含兩個掩蔽結構域，一個連接至每個第一輕鏈可變區的 氨基末端；或二價的且包含兩個掩蔽結構域，一個連接至每個第一重鏈可變區的氨基末端； 或二價的且包含四個掩蔽結構域，一個連接至每個第一輕鏈可變區和每個第一重鏈可變區 的氨基末端，例如其中兩個掩蔽結構域是第二輕鏈可變區，并且兩個掩蔽結構域是第二重 鏈可變區，其中第二輕鏈可變區和第二重鏈可變區形成第二可變結構域。第二可變結構域 可以與組織因子（TF)、紅細胞或白蛋白結合。掩蔽結構域可以是白蛋白結合蛋白。對象可 以是人或非人哺乳動物。對象可以患有創傷、血友病(例如血友病A或B)或癌癥。抗體可 以全身施用，或者局部或區域性施用于出血部位。抗體可以皮下、靜脈內或動脈內施用。抗 體可以與人組織因子途徑抑制劑的Kunitz結構域2結合。
[0014] 考慮本文描述的任何方法或組合物可以對本文描述的任何其他方法或組合物而 言應用。
[0015] 當與術語"包含"結合用于權利要求和/或說明書中時，單詞"一個"或"一種"的 使用可以意指"一個/種"，但它還與"一個或多個/ 一種或多種"、"至少一個/種"和"一個 或超過一個/ 一種或超過一種"的含義一致。
[0016] 考慮在本說明書中討論的任何實施方案均可對本發明的任何方法或組合物而言 應用，并且反之亦然。此外，本發明的組合物和試劑盒可以用于實現本發明的方法。
[0017] 本申請自始至終，術語"約"用于指示，該值包括關于裝置、用于測定值的方法的固 有誤差變異，或在研究對象中存在的變異。
[0018] 附圖簡述 下述附圖構成本說明書的部分，并且包括以進一步證實本公開內容的某些方面。通過 參考與本文呈現的具體實施方案的詳細描述組合的這些附圖中的一個或多個，公開內容可 以得到更好理解。
[0019] 圖1.抗TFPI前體藥物抗體及其如何在體內起作用的實施方案的舉例說明。
[0020] 圖2.抗TFPI前體藥物抗體的潛在掩蔽策略的舉例說明。
[0021] 圖3A-B. TF結合前體藥物的載體圖，其中針對TFPI和TF的可變區是串聯連接 的。（圖3A)HCl-pTTF5 gA200抗TFPI前體藥物抗體片段的載體圖。（圖3B)LCl-pTTF 641 抗TFPI前體藥物抗體片段的載體圖。
[0022] 圖4A-C. TF結合前體藥物和RBC結合前體藥物的載體圖，其中針對TF或RBC的 scFv在抗TFPI抗體的重鏈的氨基末端上連接。（圖4A)pQMl-3E10sc-gA200HC抗TFPI前 體藥物抗體片段的載體圖。（圖4B) pQMl-T119sC-gA200HC抗TFPI前體藥物抗體片段的載 體圖。（圖4C) pQMl/gA200LC抗TFPI前體藥物抗體片段的載體圖。
[0023] 圖5A-B.白蛋白結合前體藥物的載體圖。（圖5A)pQMl-56E4-gA200H抗TFPI前體 藥物抗體片段的載體圖。（圖5B) pQMl-56E4-gA200L抗TFPI前體藥物抗體片段的載體圖。
[0024] 圖6.使用考馬斯染色，以及在不含二硫蘇糖醇（DTT)的非還原條件和含DTT的還 原條件下，3E10-scFv-gA200 和 Terll9-scFv-gA200 抗 TFPI IgG 的 SDS-PAGE0
[0025] 圖7.相對于天然gA200,測定56E4-gA200的結合親和力的TFPI結合ELISA的曲 線。
[0026] 圖8.作為抗體濃度的函數，與RBC結合的Terll9sc_gA200的曲線。
[0027] 圖9.在人血清白蛋白（HSA)的存在或不存在下，關于不同抗TFPI前體藥物抗體 和未經修飾的抗TFPI抗體gA200與TFPI的相對結合百分比的BIAC0RE?測量結果的曲線。
[0028] 圖10A-G.(圖10A)作為抗TFPI前體藥物抗體、56E4-gA200和抗TFPI抗體gA200 的抗體濃度的函數的峰凝血酶曲線。（圖10B)作為抗TFPI前體藥物抗體、56E4-gA200和 抗TFPI抗體gA200的不同濃度的函數的凝血酶生成曲線，顯示在每個抗體濃度產生的凝血 酶濃度。（圖10C)前體藥物TPP-2654與其親本抗體gA200的凝血酶生成概況的比較，所 述TPP-2654可以通過凝血酶和FXa活化兩者進行活化。通過添加外源凝血酶，隨后添加水 蛭素以使加入的凝血酶失活，來評價凝血酶活化ΤΡΡ-2654的能力。對照包括其中加入緩沖 液代替凝血酶的反應。（圖10D)顯示了活化前體藥物ΤΡΡ-2654所需的凝血酶的滴定。測 試的凝血酶濃度為在生理學上潛在可達到的范圍內。（圖10Ε)間接評價FXa活化前體藥物 ΤΡΡ-2654的能力。FXa和凝血酶水平通過增加用于起始TGA反應的TF濃度得到增加。通 過比較外源凝血酶增強ΤΡΡ-2654應答的能力與通過FXa和凝血酶活化兩者實現的那些，可 以衡量FXa活化前體藥物的相對貢獻。（圖10F)顯示了通過單獨的凝血酶活化的前體藥物 ΤΡΡ-2654的凝血酶生成。此處，滴定研究指示前體藥物ΤΡΡ-2654需要~2. 5 U/mL凝血酶， 以轉換為活性TFPI Ab。（圖10G)在TF滴定實驗結果中，可以觀察到TPP-2652對FXa的相 對不敏感性。與設計為通過FXa和凝血酶活化兩者活化的ΤΡΡ-2654形成對比，TPP-2652顯 示在使用的更高TF劑量下在凝血酶生成中的更少增加（比較圖IOG與圖10Ε)。
[0029] 圖11.不同濃度的白蛋白對抗TFPI前體藥物抗體和未經修飾的抗TFPI抗體的作 用的曲線。
[0030] 圖12.可以組合以制備根據本公開內容的抗TFPI前體藥物抗體的重鏈和輕鏈的 序列。
[0031] 圖13.根據本公開內容的抗TFPI前體藥物抗體的重鏈和輕鏈的序列。
[0032] 圖14Α-Β.根據本公開內容的抗TFPI前體藥物抗體的所選重鏈（圖14Α)，以及重 鏈和輕鏈（圖14Β)的氨基末端序列。
[0033] 圖15Α.在人或猴白蛋白的不存在或存在下，白蛋白結合抗TFPI前體藥物的TFPI 結合(表面等離子體共振-