對普羅威登斯菌o34和o46特異的核苷酸及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及對普羅威登斯菌034和046血清型特異的核巧酸，尤其設及對普羅威 登斯菌034和046血清型0抗原基因簇中單個基因特異的核巧酸及其應用。
【背景技術】
[0002] 普羅威登斯菌（/3_r〇Ki沁ncia)是腸桿菌科中一種常見的革蘭氏陰性菌，是一種機 會致病菌。主要通過院內感染或者食用海鮮感染該菌，可W引起呼吸道感染，也可引發敗血 癥、泌尿系感染、繼發性腦膜炎等。分離于腹瀉大便、尿道感染、傷口、燒傷和菌血癥標本。
[0003]細菌分型與鑒定方法主要有傳統的表型方法、血清學方法W及分子鑒定方法。然 而，隨著分子生物學的發展，傳統的血清分型和鑒定方法存在著一定的問題，如血清分型運 種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數量不足，大量的抗血清在制備和 儲存中也存在一些困難。另一方面血清分型方法耗時長、靈敏度低、漏檢率高、準確性差，不 同的0抗原產生的抗血清之間經常存在交叉反應。因此，建立基于分子生物學技術的血清 鑒定方法成為發展方向。
[0004]普羅威登斯菌的分子鑒定越來越受到人們的重視，成為普羅威登斯菌菌種與株型 鑒定的重要依據，不少新菌也因此產生。分子生物學檢測技術具有速度快且易于大規模使 用的優點，是目前國際上公認的致病菌檢測的發展方向，但當前的難點在于DNA祀標分子 特異性較低。細菌表面多糖抗原的多樣性是由負責其合成的基因簇的遺傳多樣性導致的。 長期W來，人們一直試圖探索存在于普羅威登斯菌中的表面多糖抗原運一重要致病因子的 多樣性情況及相應的遺傳進化基礎。但該研究方向上總體進展非常緩慢，針對其多糖抗原 多樣性和變異規律方面的認識基本還是空白，例如：人們尚不了解普羅威登斯菌中存在多 少種表面多糖抗原W及哪些表面多糖抗原對于該菌的致病性和流行性具有重要意義，負責 其表面多糖抗原合成的基因簇尚未被定位(其它單位預測的部分表面多糖抗原基因均不能 與解析的多糖抗原化學結構很好對應）等。造成上述現象的主要原因是：多糖抗原合成基 因簇組成復雜、基因功能較難預、糖合成基因鑒定困難等。此外，已進行部分相關研究的單 位大多缺乏前期研究基礎。
[0005]在本發明中，我們在獲得普羅威登斯菌全部表面多糖抗原基因簇序列信息的基礎 上，建立普羅威登斯菌分子血清學分型系統和快速檢測方法，具有重要的科學意義和較強 的應用價值。
[0006]近年來，越來越多的分子技術用于病原菌的分型、鑒定、檢測及病害診斷，包括轉 錄間隔區（口巧序列分析、隨機擴增長度多態性（RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長度 多態性（RFL巧分析等。分子生物學方法不僅可用于普羅威登斯菌的快速血清分型篩查， 穩定的鑒定結果可W彌補表型特征鑒定方法的不足。和傳統檢測技術相比，運些基于多聚 酶鏈式反應（PCR)的分子檢測技術，不需要經過病原菌的分離、純培養等過程，而且具有快 速、靈敏、特異性強等優點。
[0007] 聚合酶鏈式反應技術（Polymerasechainreaction,簡稱PCR技術）作為微生物 檢測技術目前正在得到認同和推廣，該技術相對于傳統的方法有高通量、檢測速度快、特異 性強、靈敏度高等優點，只需對樣品進行簡單的預增菌或增菌過程，再通過離屯、及裂解制備 細菌DNA模板，就可W在高特異性引物介導下的PCR過程中擴增目標序列，達到檢測樣品中 是否含有待測的致病性微生物的目的。運對檢驗檢疫部口和臨床檢驗無疑極大提高了工作 速度和降低了工作成本。不論從國內和國際的角度來看，快速、準確地鑒定出血清類型，為 普羅威登斯菌的防控提供有效技術支持是十分重要的。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于提供了本發明設及對普羅威登斯菌034和046血清型特異的核 巧酸，其特征在于所述的核巧酸具有： 1) 沈QIDNO: 1-4所示的核巧酸中的至少一種； 2) 與SEQIDNO: 1-4所示的核巧酸互補的核巧酸中的至少一種 所述的沈QIDNO: 1-4如下：
本發明還提供了一種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DM聚合酶，所述PCR引物為如SEQIDNO: 1-4所示的核巧酸中的一對引物（其中SEQIDNO: 1與SEQIDNO: 2 配對使用；SEQIDN0:3與SEQIDN0:4配對使用）。所述的試劑盒，還包括如下試劑：10 mldNTP30yl;5X酶特異性反應緩沖液巧XGoldStarBestPCRBufferwithMg2+) 50y1 ;5U/y1 耐熱DM聚合酶（GoldStarBestDMPolymerase) 5y1 ;-對引物（其中 沈QIDNO: 1與沈QIDNO: 2配對使用；SEQIDNO: 3與沈QIDNO: 4配對使用)混合物(體 積比為1:1) 10y1;陽性對照品10y1 ;陰性對照品10y1 ;d地20 5ml。
[0009] 本發明進一步公開了對普羅威登斯菌034和046血清型特異的SEQIDNO: 1-4核 巧酸在制備用于檢測普羅威登斯菌034和046血清型的PCR試劑盒方面的應用。本發明所 述普羅威登斯菌可W取樣于腹瀉大便、尿道感染、傷口、燒傷和菌血癥標本的培養物的粗提 液，或是普羅威登斯菌的純培養物的粗提液等。收集普羅威登斯菌提取基因組是采用常規 方法制備獲得。
[0010] 針對普羅威登斯菌的PCR試劑盒，整個檢測步驟包括樣品預處理一擴增一電泳檢 測結果。引物和PCR反應體系所需要的試劑已預先加入擴增管中，使用者只需將預處理后 的樣本加入擴增管啟動擴增反應，即可簡單快速地完成檢測工作。
[0011] 本發明公開的對普羅威登斯菌034和046血清型特異的核巧酸與現有技術相比， 具有如下優點： (1)實用性強 本發明建立的一種PCR反應體系，可檢測普羅威登斯菌034和046血清型，提供血清分 型檢測所用到的特異引物，利用該PCR方法可W對臨床標本進行檢測。
[001引（2)準確性高 本發明通過對普羅威登斯菌的各血清型特異的基因的PCR反應，每個樣品得到一條目 的條帶，將得到目的片段與已知長度相比較，就可W得到普羅威登斯菌所屬的血清型。
[0013] (3)檢測成本相對較低 可W推廣應用于食品衛生監督、環境監測、尚品監測檢驗檢疫等領域，并為其他不同致 病菌檢測組合提供技術模式。
[0014]
【附圖說明】： 圖1表示本發明034血清型r巧基因P1和P2引物檢測普羅威登斯菌034血清型和其 他血清型標準菌株電泳結果圖。除034血清型出現了 539bp的目的條帶外，其余的血清型 沒有任何條帶產生。具體菌株信息見表2; 圖2表示本發明034血清型r巧基因P1和P2引物種特異性的鑒定電泳結果圖。除 034血清型出現了 539bp的目的條帶外，其余檢測的霍亂弧菌（K/ArocAoierae)，普通變 形桿菌（化〇祐化W公aris),銅綠假單胞菌（Ae化/c咖mssaery知nosa),福氏志賀氏 隹{Shigella,flexnerf),潛I:構顆巧隹Wnterobactercloacae),副溶血弧菌（K/Aro parahaemolyticus),沙 口氏菌（擁心曲口打e77ae打terica)和大腸桿菌（公calf) 各1株，均無任何條帶產生。具體菌株信息見表2 ; 圖3表示本發明046血清型r巧基因P3和P4引物檢測普羅威登斯菌046血清型和其 他血清型標準菌株電泳結果圖。除046血清型出現了 79化P的目的條帶外，其余的血清型 沒有任何條帶產生。具體菌株信息見表2; 圖4表示本發明046血清型r巧基因P3和P4引物種特異性的鑒定電泳結果圖。除 046血清型出現了 79化P的目的條帶外，其余檢測的霍亂弧菌（片ArocAoierae)，普通變 形桿菌（化〇祐化W公aris),銅綠假單胞菌（Ae化/c咖mssaery知nosa),福氏志賀氏 售[iShigella.flexnerf)，潛\犯頗巧MiEnterobactercloacae),副溶血弧菌（片Aro parahaemolyticus''),餐 \飛&隹{Salmonellae打terica)和大月易桿菌（公scAe>ricAiacalf) 各1株，均無任何條帶產生。具體菌株信息見表2 ; 圖5表示分別用034和046特異引物擴增對應血清型的電泳結果圖。具體菌株信息見 表2。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解運些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊（NewYork:ColdSpringHarborL油oratory Press, 1989)中所述的條件。其中普羅威登斯菌來源于波蘭羅茲大學。
[001引連施例1:基閑紀的提取 37°C營養肉湯培養基培養普羅威登斯菌，收集細菌，提取基因組具體步驟如下： 用500y1 50mMTris-肥1 (P冊.0)和lOul0. 4M邸TA重懸細胞，37°C溫育20分鐘， 然后加入10y1lOmg/ml的溶菌酶繼續保溫20分鐘。之后加入3y1 20mg/ml的蛋白酶K、 15yl10%SDS，50°C溫育2小時，再加入3yllOmg/ml的RNase，65°C溫育30分鐘。加等 體積酪抽提混合物，取上清液，再用等體積的酪：氯仿：異戊醇（25 :24 :1)溶液抽提兩次，取 上清液，再用等體積的乙酸抽提W除去殘余的酪。上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃 絲卷出DM并用70%乙醇洗DM,最后將DM重懸于30y1TE緩沖液中。基因組DM通過 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0017]連施例2:序列破譯 提取普羅威登斯菌034和046血清型標準菌株的基因組，通過Solexa pair-end測序技 術對普羅威登斯菌各個血清型基因組進行全基因組測序獲得該血清型的序列，運用Blast 及PSI-Blast進行序列比對，采用TMHMM 2. 0 program進行跨膜結構預測，運用ClustalW program進行序列對齊及篩選保守和特定基因片段，最終獲得普羅威登斯菌各個血清型的 0抗原基因簇序列及破譯結果。
[0018]連施例3:引物巧計 根據基因簇破譯情況，我們發現基因確實是血清型特異的基因，所W選取該 基因特異區段設計特異引物。由于更加特異，所W主要Wr巧基因為祀基因。
[0019]引物設計是該發明的核屯、部分。設計引物根據文獻中敘述的特異基因來設計。WZX 和r巧想兩個基因是普羅威登斯菌0抗原基因簇中比較特異的基因，可W作為血清型鑒定 的祀基因。將上述基因導入PrimerPremier5進行引物設計，引物的長度最好在18~24bp 之間，Tm值在50~55°C。每個基因設計一對引物