密執安棒形桿菌不同亞種的條形碼鑒定方法及其專用引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，尤其設及一種鑒定密執安棒形桿菌不同亞種的條形碼 方法及其專用引物。
【背景技術】
[0002] 棒形桿菌屬（Clavibacter，原為Corynebacterium)細菌，1954 年，Davis 將含有2, 4二氨基下酸的一些菌歸類并設立了棒形桿菌屬新種一密執安棒形桿菌 種（Clavibactermichiganensis)。根據寄主植物的不同一般將密執安棒形桿菌 (Clavibactermichiganensis)分為五個亞種：詭橘亞種（Clavibactermichiganensis subsp.insidiosus，首猜細菌性萎黨病菌）、密執安亞種（Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis,番茄潰瘍病菌）、內布拉斯加亞種（Clavibactermichiganensis subsp.nebraskensis，玉米內州萎黨病菌）、環腐病亞種（Clavibactermichiganensis subsp.s巧edoni州s,馬鈴馨環腐病菌）、棋盤狀亞種（Clavibactermichiganensissubsp. tessellarius，小麥細菌性花葉病菌）。上述病菌均能通過種子或種苗進行遠距離傳播，并 能造成嚴重危害，前四個亞種被列為中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物。
[0003] 口岸檢疫是防控有害生物傳入傳出的有效途徑，準確的檢測鑒定是口岸檢疫的重 要措施，因此加強對該屬病原細菌的檢測鑒定技術研究具有重要意義。國內外研究人員采 用了多種方法如直接觀測法、生物學測定法、血清學檢測和分子生物學檢測法等對該屬細 菌的檢測鑒定做了大量的研究。隨著育種的國際化和植物種質資源引進交流大幅度增加， 口岸檢疫對該屬檢疫性細菌的檢測鑒定方法也提出了更高的要求。棒形桿菌屬下的四個檢 疫性植物病原細菌，目前常用的分子檢測方法主要有PCR凝膠電泳、實時巧光PCR、LAMP等 方法，運類方法適合于目標細菌的特異性檢測，但對于未知病原菌的鑒定不適合。
[0004] DNA條形碼技術是近年來出現的一種新的物種鑒定技術，由加拿大Guel地大學的 分類學家Paul化bed在2003年首次提出，其在物種標準化鑒定方面的優勢已備受關注。 線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(C0I)基因作為動物的DNA條形碼已廣泛應用于物種鑒定 中；在植物上已選定葉綠體rbcl和matK基因作為基本的DNA條形碼；真菌學家正對真菌類 群進行不同基因片段的篩選與評價，W口S作為真菌的首選DNA條形碼。條形碼技術是分類 學中輔助物種鑒定的新技術，它代表了生物分類學研究的一個新方向，而且隨著測序技術 的發展和普及，DNA條形碼技術為出入境境檢驗檢疫提供了一種簡單而有效而且容易標準 化的方法。在細菌方面，雖然很早就利用16SrDNA序列進行分類與鑒定，但由于16SrDNA 序列的保守性強，區分能力有限，對于種及種下階元的鑒定很難。植物病原細菌在分類上與 經典的細菌分類還不盡相同，自然感染寄主的差異是病原細菌鑒定的一個重要指標，但在 現實檢測中依靠寄主差異進行檢測鑒定具有很大難度，目前很多分類學家和檢測技術人員 正研究尋找適合細菌種及種下階元快速鑒定的通用DNA條形碼基因。
【發明內容】
陽〇化]本發明的一個目的是提供鑒定密執安棒形桿菌不同亞種的條形碼引物。
[0006] 本發明提供鑒定密執安棒形桿菌不同亞種的條形碼引物，為對片段A進行擴增和 /或測序使用的引物，所述片段A為W密執安棒形桿菌不同亞種的基因組DNA為模板，用序 列1所示的引物和序列2所示的引物進行擴增得到的片段。
[0007] 上述條形碼引物中，其由引物cmhspF和引物cmhspR組成；所述引物cmhspF的核 巧酸序列為序列表中序列1，所述引物cmhspR的核巧酸序列為序列表中序列2。
[0008] 本發明的另一個目的是提供鑒定密執安棒形桿菌不同亞種的PCR試劑。
[0009] 本發明提供的PCR試劑，由上述的條形碼引物、PCR擴增緩沖液和水組成，所述條 形碼引物中的引物cmhspF和引物cmhspR在所述PCR試劑中的終濃度均為0. 5jiM。
[0010] 本發明的第3個目的是提供鑒定密執安棒形桿菌不同亞種的PCR試劑盒。
[0011] 本發明提供的試劑盒，包括上述的條形碼引物或上述的PCR試劑。
[0012] 上述引物組或PCR試劑或PCR試劑盒中，所述密執安棒形桿菌不同亞種為首猜細 菌性萎黨病菌、馬鈴馨環腐病菌、玉米內州萎黨病菌、馬鈴馨環腐病菌及小麥細菌性花葉病 困。
[0013] 上述的引物組或PCR試劑或PCR試劑盒在鑒定或區分密執安棒形桿菌不同亞種中 的應用也是本發明保護的范圍。
[0014] 上述的引物組或PCR試劑或PCR試劑盒在制備鑒定或區分密執安棒形桿菌不同亞 種產品中的應用也是本發明保護的范圍。
[0015] 本發明第4個目的是提供鑒定或輔助鑒定不同待測密執安棒形桿菌是否為同一 亞種的方法。
[0016] 本發明提供的方法，包括如下步驟：
[0017] 1)分別提取不同待測密執安棒形桿菌的基因組DNA，利用上述的引物組進行PCR 擴增，得到不同待測密執安棒形桿菌的PCR擴增產物；
[001引。將所述不同待測密執安棒形桿菌的PCR擴增產物測序，得到不同待測密執安棒 形桿菌的PCR擴增產物序列；
[0019] 3)將不同待測密執安棒形桿菌的PCR擴增產物序列進行聚類分析，聚為一簇的待 測密執安棒形桿菌為一類亞種。
[0020] 上述方法中，所述PCR擴增的退火溫度為55°C。
[0021] 本發明第5個目的是提供鑒定或輔助鑒定待測密執安棒形桿菌的亞種類型的方 法。
[0022] 本發明提供的方法，包括如下步驟：
[0023] 1)分別提取待測密執安棒形桿菌的基因組DNA，利用上述的引物組進行PCR擴增， 得到待測密執安棒形桿菌的PCR擴增產物；
[0024] 2)將所述待測密執安棒形桿菌的PCR擴增產物測序，得到待測密執安棒形桿菌的 PCR擴增產物序列；
[0025] 3)將待測密執安棒形桿菌的PCR擴增產物序列與Genbank數據庫密執安棒形桿菌 不同亞種代表種的核巧酸序列進行聚類分析，所述待測密執安棒形桿菌的PCR擴增產物序 列與Genbank數據庫密執安棒形桿菌某個亞種的核巧酸序列聚為一簇，則該待測密執安棒 形桿菌為該種亞種。
[0026] 所述方法中，所述Genbank數據庫密執安棒形桿菌不同亞種代表種的核巧酸序列 為序列表中序列23-序列29 ;所述PCR擴增的退火溫度為55°C。
[0027] 在上述應用或方法中，所述密執安棒形桿菌不同亞種為首猜細菌性萎黨病菌、馬 鈴馨環腐病菌、玉米內州萎黨病菌、馬鈴馨環腐病菌及小麥細菌性花葉病菌。 陽02引本發明的實驗證明，使用本發明所提供的引物組cmhspF和引物cmhspR，在驗證中 100%擴增到密執安棒形桿菌各亞種，測序成功率為100%，能夠有效對該種內不同亞種進 行鑒定，可在進境植物及其產品檢疫中應用，防止病原細菌的傳入傳出，也可在國內的植 保植檢站、科研院所、農業生產企業及農戶中推廣應用。
【附圖說明】
[0029] 圖1為密執安棒形桿菌不同亞種條形碼序列構建的系統進化樹。
【具體實施方式】
[0030] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0031] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0032] 實施例1、用于密執安棒形桿菌不同亞種的條形碼引物的合成
[0033]WGenbank中密執安棒形桿菌5個亞種序列作為的對象，分析其序列保守區域，根 據條形碼引物設計的條件即擴增片段長度、擴增片段種內的保守性和種間的變異性設計并 人工合成引物組cmhspF和cmhspR，用于鑒定密執安棒形桿菌不同亞種，條形碼引物擴增產 物長度約為6(K)bp。
[0034] cmhspF的核巧酸序列為序列表中的序列1，cmhspR的核巧酸序列表中的序列2。
[0035] 實施例2、條形碼引物鑒定密執安棒形桿菌不同亞種
[0036] 為了驗證實施例1制備的用于鑒定密執安棒形桿菌不同亞種的條形碼引物的通 用性，本實施例選擇首猜細菌性萎黨病菌、馬鈴馨環腐病菌、玉米內州萎黨病菌、馬鈴馨環 腐病菌及小麥細菌性花葉病菌進行評價。
[0037]首猜細菌性萎黨病菌（Clavibacter michiganensis. subsp. insidiosus)，編號為 NCPPB1634 CMI，LMG7323 CMI，LMG7295 CMI，公眾可從中國檢驗檢疫科學研究院獲得。
[0038]番茄潰瘍病菌（Clavibacter michiganensis. subsp. michiganensis)編號為 NCPPB2979 CMM，NCPPB382 CMM，LMG3681 CMM，LMG5604 CMM,公眾可從中國檢驗檢疫科學研 究院獲得。
[0039]玉米內州萎黨病菌（Clavibacter michiganensis. subsp. nebraskensis)編號為 ATCC27822 CMN, LMG3700 CMN, NCPPB2581 CMN, LMG5627 CMN, ATCC27794 CMN, ATCC27795 CMN，公眾可從中國檢驗檢疫科學研究院獲得。
[0040]馬鈴馨環腐病菌（Clavibacter michiganensis. subsp. sepedonicus)編號為 LMG5922 CMS，LMG6382 CMS，LMG5861 CMS,公眾可從中國檢驗檢疫科學研究院獲得。
[0041]小麥細菌性花葉病菌（Clavibacter michiganensis. subsp. tessellarius)編號NCPPB3664 CMT，ATCC33566 CMT，NCPPB3665 CMT，公眾可從中國檢驗檢疫科學研究院獲得。 [0042]菜豆細菌性萎黨病菌（Qi;rtobacte;rium flac州mfaciens pv. Flac州mfaciens)， 編號ATCC51876 CUR,公眾可從中國檢驗檢疫科學研究院獲得。
[0043] 1、PCR擴增
[0044] 按照細菌基因組DM提取試劑盒（天根生物技術有限公司，貨號：DP302-02)步驟 分別提取各種首猜細菌性萎黨病菌、各種番茄潰瘍病菌、各種玉米內州萎黨病菌、各種馬鈴 馨環腐病菌、各種小麥細菌性花葉病菌和菜豆細菌性萎黨病菌的基因組DNA，測定濃度后， W各菌基因組DNA為模板，分別使用實施例1的cmhspF和cmhspR引物，根據PCRmaster mi