對變形桿菌o47，o21，o32和o23特異的核苷酸及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及對變形桿菌047, 021，032和023血清型特異的核巧酸，尤其設及對變 形桿菌047, 021，032和023血清型0抗原基因簇中單個基因特異的核巧酸及其應用。
【背景技術】
[0002] 變形桿菌屬于革蘭氏陰性細菌，廣泛存在于水、±壤腐敗的有機物W及人和動物 的腸道中，對分解有機物和動物蛋白起著重要的作用，在有氧或特許條件的厭氧環境中都 具有蛋白水解酶的活性。變形桿菌為條件致病菌，多引起繼發性感染，如慢性中耳炎、創傷 感染等，也可引起膀脫炎、嬰兒腹瀉、食物中毒等。
[0003] 細菌分型與鑒定方法主要有傳統的表型方法、血清學方法W及分子鑒定方法。然 而，隨著分子生物學的發展，傳統的血清分型和鑒定方法存在著一定的問題，如血清分型運 種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數量不足，大量的抗血清在制備和 儲存中也存在一些困難。另一方面血清分型方法耗時長、靈敏度低、漏檢率高、準確性差，不 同的0抗原產生的抗血清之間經常存在交叉反應。因此，建立基于分子生物學技術的血清 鑒定方法成為發展方向。
[0004] 變形桿菌的分子鑒定越來越受到人們的重視，成為變形桿菌菌種與株型鑒定的重 要依據，不少新菌也因此產生。對桿菌而言，生化反應主要是各種酶譜的表現，屬于外部形 態的內容，核酸的相似性才是桿菌種的界定最根本、最直接的特征。因此，變形桿菌的分型 與鑒定最有效、最直接的方式應該從核酸的研究觸發，通過比較核酸(包括基因組與核酸片 段）的相似性確定變形桿菌的歸屬。
[0005] 近年來，越來越多的分子技術用于病原菌的分型、鑒定、檢測及病害診斷，包括轉 錄間隔區（口巧序列分析、隨機擴增長度多態性（RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長度 多態性（RFL巧分析等。分子生物學方法不僅可用于變形桿菌的快速血清分型篩查，穩定的 鑒定結果可W彌補表型特征鑒定方法的不足。和傳統檢測技術相比，運些基于多聚酶鏈式 反應（PCR)的分子檢測技術，不需要經過病原菌的分離、純培養等過程，而且具有快速、靈 敏、特異性強等優點。
[0006] 聚合酶鏈式反應技術（Polymerasechainreaction,簡稱PCR技術）作為微生物 檢測技術目前正在得到認同和推廣，該技術相對于傳統的方法有高通量、檢測速度快、特異 性強、靈敏度高等優點，只需對樣品進行簡單的預增菌或增菌過程，再通過離屯、及裂解制備 細菌DNA模板，就可W在高特異性引物介導下的PCR過程中擴增目標序列，達到檢測樣品中 是否含有待測的致病性微生物的目的。PCR的擴增過程僅需1個半小時。運對檢驗檢疫部 口和臨床檢驗無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。
[0007] 不論從國內和國際的角度來看，快速、準確地鑒定出血清類型，為變形桿菌的防控 提供有效技術支持是十分重要的。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于提供了一種對變形桿菌0抗原特異的核巧酸，其特征在于所述 的核巧酸為：SEQIDNO: 1-8所示的核巧酸中的至少一種：
本發明還提供了一種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物為如SEQIDN0:l-8所示的核巧酸中的至少一種。所述的試劑盒，還包括如下試劑：10 mldNTP30y1 ; 10X酶特異性反應緩沖液50y1 ;5U/y1耐熱DNA聚合酶5y1 ;引物混合 物10y1 ;陽性對照品10y1 ;陰性對照品10y1 ;d地2〇 5ml。
[0009] 其中所述的PCR引物優選為所述如SEQIDNO: 1-8所示的核巧酸中的至少一種。
[0010] 本發明進一步公開了一種對變形桿菌0抗原特異的SEQIDNO: 1-8核巧酸在制備 用于檢測變形桿菌0抗原PCR試劑盒、基因忍片或微陣列方面的應用。
[0011] 本發明所述變形桿菌可W取樣于上壤、水、垃圾、腐敗有機物的粗提液，或是變形 桿菌的純培養物的粗提液等。
[0012] 收集變形桿菌提取基因組是采用常規方法制備獲得。
[0013] 針對變形桿菌的PCR試劑盒，整個檢測步驟包括樣品預處理一擴增一電泳檢測結 果。引物和PCR反應體系所需要的試劑已預先加入擴增管中，使用者只需將預處理后的樣 本加入擴增管啟動擴增反應即可，簡單快速的完成檢測工作。
[0014] 本發明還提供一種液相檢測忍片，包括液相磁珠和連接在液相磁珠上的寡核巧酸 探針，W及相應探針所在片段所對應的相應引物；其中所述核巧酸優選為如SEQIDNO: 1-8 所示的核巧酸。
[0015] 本發明還提供一種微列陣，其包括上述的核巧酸；其中所述核巧酸優選為如SEQ IDNO: 1-8所示的核巧酸。
[0016] 所述的檢測變形桿菌指的是檢測引起食物中毒、尿路感染、風濕性關節炎、醫院內 感染等多種混合型感染的細菌。
[0017] 本發明公開的一種對變形桿菌0抗原特異的核巧酸與現有技術相比，本發明具有 如下優點： (1)實用性強 本發明建立的一種PCR反應體系，可檢測變形桿菌，提供血清分型檢測所用到的特異 引物，利用該PCR方法可W對臨床標本進行檢測。
[001引 （2)準確性高 本發明通過對變形桿菌的各血清型特異的基因的PCR反應，每個樣品得到一條目的條 帶，將得到目的片段與已知長度相比較，就可W得到變形桿菌所屬的血清型。
[0019] (3)檢測成本相對較低 可W推廣應用于食品衛生監督、環境監測、尚品監測檢驗檢疫等領域，并為其他不同致 病菌檢測組合提供技術模式。
[0020] W上所述，僅是本發明的操作和實施方法而已，并非對本發明作任何形式上的限 審IJ，凡是依據本發明的技術實質對W上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍 屬于本發明技術方案的范圍內。
[00川【附圖說明】： 圖1表示本發明047血清型特異引物檢測變形桿菌其他血清型標準菌株電泳結果圖，r巧基因P1和P2目的條帶為124bp，其余的血清型沒有任何條帶，具體菌株信息見表2 ; 圖2表示本發明047血清型特異引物種特異性的鑒定電泳結果圖，其中檢測了 4株桿 菌W及1株變形桿菌、1株普羅威登斯菌，均無任何條帶，具體菌株信息見表2 ; 圖3表示本發明021血清型wzy基因P3和P4引物檢測變形桿菌其他血清型標準菌 株電泳結果圖，wzy基因P3和P4篩選，目的條帶為49化P，其余血清型沒有任何條帶；具體 菌株信息見表2 ; 圖4表示本發021血清型wzy基因P3和P4引物種特異性的鑒定電泳結果圖，其中檢 測了 4株桿菌W及1株克雷伯菌、1株普羅威登斯菌，均無任何條帶；具體菌株信息見表2。
[0022] 圖5表示本發032血清型r巧基因P5和P6引物檢測變形桿菌其他血清型標準菌 株電泳結果圖，r巧基因P5和P6引物的篩選，目的條帶為16化P，其余的血清型沒有任何條 帶，具體菌株信息見表2; 圖6表示本發明032血清型r巧基因P5和P6引物種特異性的鑒定電泳結果圖，其中 檢測了 4株桿菌W及1株克雷伯菌、1株普羅威登斯菌，均無任何條帶，具體菌株信息見表 2; 圖7表示本發明023血清型r巧基因P7和P8引物檢測變形桿菌其他血清型標準菌株 電泳結果圖，目的條帶為168bp，其余的血清型沒有任何條帶。具體菌株信息見表2 圖8表示本發明023血清型r巧基因P7和P8引物種特異性的鑒定電泳結果圖，其中 檢測了 4株桿菌W及1株克雷伯菌、1株普羅威登斯菌，均無任何條帶。具體菌株信息見表 2 ； 圖9表示分別用047, 021，032和023特異引物擴增對應血清型的電泳結果圖，具體菌 株信息見表2 ; 其中：047, 021，032和023表示相應血清型引物擴增結果，第一個泳道M是2000bp laddermarker〇
【具體實施方式】
[0023] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解運些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊（NewYork:ColdSpringHarborL油oratory Press, 1989)中所述的條件。其中變形桿菌來源于JapanCollectionofMicroorganisms (JCM)o
[0024]連施例1:基閑紀的提取 37°C營養肉湯培養基培養變形桿菌，收集細菌，提取基因組具體步驟如下： 用500ul 50mM Tris-肥l(p冊.0)和lOul 0. 4M邸TA重懸細胞，37°C溫育20分鐘，然 后加入lOul lOmg/ml的溶菌酶繼續保溫20分鐘。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS，50°C溫育2小時，再加入3 ul lOmg/ml的RNase，65°C溫育30分鐘。加等體積酪 抽提混合物，取上清液，再用等體積的酪：氯仿：異戊醇（25 :24 :1)溶液抽提兩次，取上清 液，再用等體積的乙酸抽提W除去殘余的酪。上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷 出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ul TE中。基因組DNA通過1%的瓊脂糖 凝膠電泳檢測。
[00巧]連施例2:序列破譯 提取變形桿菌各個血清型標準菌株的基因組，通過Solexa pair-end測序技術對變形 桿菌各個血清型基因組進行全基因組測序獲得該血清型的序列，運用Blast及PSI-Blast 進行序列比對，采用TMHMM 2.0 program進行跨膜結構預測，運用ClustalW program進行 序列對齊及篩選保守和特定基因片段，最終獲得變形桿菌各個血清型的0抗原基因簇序列 及破譯結果。
[0026]連施例3:引物巧計 變形桿菌各個血清型的0抗原基因簇序列是本實驗室自測的，通過比對分析，我們選 取Blast比對結果identity和similarity值相對較低的基因特異區段設計引物。其中 047血清型的r巧基因比對結果identity值和similarity值為83%和83% ;021血清型的 r巧基因比對結果identity值和similarity值為28