一種納米細菌16sRNA基因的鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學領域，尤其設及一種納米細菌16SRNA基因的鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 根據國際前列腺炎合作網1998年提出的前列腺炎分類方法，前列腺炎共分為四 型。I型：急性細菌性前列腺炎，指前列腺急性細菌感染；II型：慢性細菌性前列腺炎，指前 列腺慢性復發性細菌感染；III型：慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合癥（CP/CPPS)，其定義 為病史在3個月W上，骨盆區疼痛或不適，不同程度的排尿或性交時不適，此型根據前列腺 按摩液、精液中白細胞計數又分為炎癥性和非炎癥性兩種亞型；IV型無臨床炎癥性前列腺 炎，沒有癥狀，只是在病理檢查或檢查其他癥狀時發現前列腺按摩液中存在白細胞才偶然 被診斷。其中I型、II型患者數量少，IV型前列腺炎因無任何癥狀，勿須處理，亦無重要臨床 意義。只有III型前列腺炎患者因常規檢查及培養未能發現明確的病原體，病因不明，發病機 制不清，不能進行針對性治療，臨床療效差，而且患者數量占臨床慢性前列腺炎患者的60% 社。
[0003] 研究發現納米細菌能分泌巧化脂多糖生物膜，具有較強的毒性。人體內感染的納 米細菌，主要經泌尿系統排出體外。排尿時尿道高壓可引起尿液返流進入前列腺導管和腺 胞內，在此過程中，尿液中的納米細菌容易被伴隨轉移，進入到前列腺內，運可能在納米細 菌感染前列腺過程中發揮主要和積極的作用。此外，前列腺導管細長、彎曲、開口處口徑小， 與尿道成直角或斜行向上進入尿道，也有利于尿道病原體進入腺體，不利于腺體炎性滲出 物排除和引流，病原體可長期寄生在其中。W上諸多因素為納米細菌在前列腺內感染和致 病提供了條件和可能。
[0004] 關于納米細菌與III型前列腺炎和前列腺結石可能存在的病因學關系，目前國內外 只有少數學者在臨床方面進行了探索。Jones等最初研究結果顯示，前列腺炎患者血清中 納米細菌抗原經過化ISA分析檢出率顯著高于正常男性及前列腺增生患者。Shoke等通過 對頑固性III型前列腺炎伴結石患者用四環素抗納米細菌治療后，發現患者臨床癥狀顯著改 善，結石變小或消失；還有人分別從III型前列腺炎患者的EPS及前列腺結石中分離、培養出 納米細菌細菌，并發現其中納米細菌具有較高感染率，分別達62. 5%、65%。在針對性治療 后，EPS中納米細菌陽性率明顯下降。因此推斷納米細菌與III型前列腺炎和前列腺結石之 間存在著較密切關系，考慮為其重要病因。
【發明內容】
[0005] 本發明實施例的目的在于提供一種納米細菌16SRNA基因的鑒定方法，旨在探索 III型前列腺炎及結石的病因和發病機制，解除患者痛苦，減少病患和社會醫療機構的資金 支出，節約更多的醫療資源。
[0006] 本發明是運樣實現的，一種納米細菌16SRNA基因的鑒定方法包括：
[0007]步驟一、根據納米細菌 16sRNA基因序列（GeneBankaccessionnumber:X98419) 設ir|對弓I物女曰下；5，_aac邑aac邑act邑邑邑邑c邑邑ca邑邑c_3，；5,一cacccca邑tc邑ct邑accc_3，進行 引物合成，Primer Name :A，Lot No :AW09639，TM :66. 00 ;Primer Name :B，Lot No :AW09640， TM :64. 13 ;
[000引步驟二、提取納米細菌全基因組DM,具體包括：
[0009] (1)制備菌液，用于提取納米細菌全基因組DNA的菌液可W有S種不同的來源：① 從III型前列腺炎患者EPS中獲得；②從前列腺結石中獲得；③從標本的培養液中獲得；
[0010] (2)按TIANDZ公司細菌DNA0UT使用手冊VI. 3進行操作；
[0011] 步驟立、用合成的引物進行PCR擴增；
[0012] 步驟四、按TIANDZ公司柱式DNABACK使用手冊V2. 2進行操作，回收特異性擴增片 段；
[0013] 步驟五、按TaKaRa PMD18-T Vector使用手冊D101A進行操作，擴增片段克隆到 PMD-18T；
[0014] 步驟六、轉化的質粒進行核巧酸測序，將測序結果與納米細菌16SRNA序列進行比 較，鑒定新分離的納米細菌。
[0015] 進一步，=種不同來源的菌液的制備方法分別為：
[0016] (1)取Im化PS，用生理鹽水稀釋5倍，經0. 45um濾器過濾，4°C離屯、40min(20， 000Xg)，棄上清，留取管底1ml充分混勻，再用無菌生理鹽水稀釋5倍，經0. 22um濾器過 濾，4°C離屯、40min(20,000Xg)，棄上清，留取管底沉淀，加入1當量鹽酸0. 5mr混勻，37°C放 置30min;加入1MTris0. 5ml中和，22000g離屯、40min，留沉淀備用；
[0017] 似手術中無菌采取患者的結石標本，在1N肥1中浸泡30min，W去除礦物質，加 入0. 5MTriS進行中和，娠碎結石，用生理鹽水配成5 %濃度，用0. 22ym濾膜過濾，4°C離屯、 40min(20000Xg)，留沉淀備用；
[0018] (3)標本培養4周后，培養管底部出現白色菌群沉淀，將培養管中的培養基大部分 棄去，留取管底部分lOOul，徹底混勻后，移入離屯、管中，加入適量生理鹽水，22000g離屯、 40min;去上清，沉淀中加入1當量鹽酸0. 5ml混勻，37°C放置30min;加入1MTris0. 5ml 中和，22000g離屯、40min，留沉淀備用。
[0019] 進一步，按TIANDZ公司細菌DNA0UT使用手冊VI. 3進行操作，具體方法為：
[0020] (1)如果試劑盒內的溶液A和溶液B產生沉淀，需要65°C預熱沉淀溶解，搖勻待 用；
[002。 似將0. 1-1. 5血過夜培養的菌液轉移到1. 5血塑料離屯、管中，室溫 12000-15000g離屯、1分鐘沉淀細菌，棄上清；
[00過 做加入600yL溶液A到細菌沉淀中，吹打均勻；
[002引 （4)加入150yL溶液B到離屯、管中，顛倒數次混勻后溶液中將有白色絲狀懸浮物 產生，溶液B比較粘稠，可W在天平上稱取150-160mg，也可W將ImL槍頭剪去一截再吸取；[0024] (5)室溫放置3-5分鐘。如果放置在65°C，可W提高DNA產量10-20%;
[00巧](6)加入200iiL自備氯仿，震蕩混勻10-30秒，溶液將呈乳白色；
[002引 （7) 12000-15000g室溫離屯、2分鐘，上清透明，中間層有白膜，小屯、轉移上清到新 的1. 5mL塑料離屯、管中，避免觸及中間層的白膜；
[0027] (8)在約750yL上清液中加入1倍體積的異丙醇，用手上下顛倒30秒混勻，此時 一般將有絮狀DM沉淀出現，室溫下12000-15000g離屯、3分鐘，棄上清，管底將有微小DM沉淀；
[002引（9)沉淀用1血75%乙醇清洗2次后，短暫離心吸棄殘留的液體約50yL，立即加 入50-100yL自備的TE緩沖液溶解DNA沉淀；
[0029] (10)如果在第4步沒有加RNaseA，或加后還有殘留的RNA污染，可化扣入5-15iiL RNaseA溶液，37°C保溫30分鐘，直接取5-10yL電泳檢測DNA，如果需要測0D，則必須將降 解的RNA通過乙醇沉淀去除；
[0030] 進一步，用合成的引物進行PCR擴增，具體包括：
[0031] (l)PCR反應體系：
[0032] TaKaRa EX Tag(5U/ul) 化25川 10XEX Tag Buffer(Mg2 + Free) Mgcl2(25mM) 4jal :御TP Mixture(各2.5mM ). 4|il
[0033] 摸板DNA 2.5ng 引物l(20uM) i|il 引物2口OuM) 1片1 ddH20 up1:050ji I
[0034] 似PCR反應條件：
[0035]
[0036] (3)結果檢測：反應結束后取5y1反應產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測；
[0037] 進一步，步驟四所述的按TIANDZ公司柱式DNABACK使用手冊V2. 2進行操作，回收 特異性擴增片段的具體方法為：
[003引 （1)切取含DNA片段的瓊脂糖凝膠lOOmg左右，，放入1. 5血離屯、管中，用移液槍頭 搗碎，按重量比為1 :3到1 :5的比例加入通用溶膠液；
[0039] (2)將離屯、管在手中搖晃約5分鐘使膠完全溶化，其間可W振蕩數次W促進瓊脂 糖凝膠的溶化，如果所加通用溶膠液體積大于500y以可適當增加溶膠時間；
[0040] (3)將離屯、管中的溶液轉移到高載量離屯、吸附柱中，套上液體收集管，靜置3分 鐘，12000-15000g離屯、1分鐘并倒掉收集管中的液體，若一次加不完，可分兩次加入并離 屯、；
[0041] (4)加入500yL通用洗柱液于離屯、柱中，12000-15000g離屯、1分鐘，倒棄收集管 中的廢液；
[004引妨重復第（4)步操作1次；
[004引（6) 12000-15000g離屯、1分鐘W去除離屯、柱中的殘留液體；
[0044] (7)將離屯、柱置于一新的干凈的離屯、管中，加25-50yL50-65°C預熱的P冊.0的 TE溶液，靜置3分鐘，12000-15000g離屯、1分鐘；
[0045] (8)離屯、管底部所得溶液即為純化的DNA溶液，可立即用于后續實驗或者放冰箱 長期保存。
[0046] 進一步，步驟