蟹殼下腳料抗氧化肽鏈的制備方法
【專利說明】蟹殼下腳料抗氧化肽鏈的制備方法
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技術領域
[0002]本發明涉及到一種蛋白抗氧化肽的制備方法，尤其涉及蟹殼下腳料抗氧化肽鏈的制備方法。
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【背景技術】
[0004]中國水產品產量約占世界總產量的三分之一，但加工率約30%，與美國等國家的80%差距較大，水產品加工和綜合利用技術還需進一步提高。目前，我國水產品加工副產物利用率較低，而國外己經達到根據副產物化學組成和生化特性進行有效分類利用，加工產值甚至超過魚肉的幾倍到幾十倍。蝦蟹類水產品加工過程中產生大量的蝦頭、蝦殼、蟹殼、蟹腿等下腳料，仍含有大量蛋白質、不飽和脂肪酸、有機鈣、甲殼素等多種營養成份和活性物質，有較好利用前景。
[0005]抗氧化劑可以減弱或祛除自由基對人體的損害，或者保護食品免受氧化損傷變質。化學合成抗氧化劑，如叔丁基對苯二酚、丁基羥基茴香醚、沒食子酸丙酯、二丁基羥基甲苯等，價格便宜，廣泛地應用到食品工業中。但是，化學合成抗氧化劑不同程度上損傷人體的肝臟、腎臟等器官，部分國家和地區已經明確限量或禁止使用。因此，研發高效、安全的天然抗氧化劑成為熱點。抗氧化肽由于其食用安全、利用度高、無毒副作用等優點受到廣泛重視。
[0006]申請人發現以蟹殼下腳料為原料，利用酶解技術制備蟹殼下腳料抗氧化肽的工藝研究處于空白階段，而以蟹殼下腳料酶解產物為材料制備高活性抗氧化肽及其應用更是未見報道。
【發明內容】
[0007]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀提供一種具有抗氧化活性、對人體安全的蟹殼下腳料抗氧化肽鏈的制備方法。
[0008]上述蟹殼下腳料抗氧化肽鏈的制備方法，其特征在于包括下述步驟:
I)蟹殼下腳料預處理:取過100目篩的蟹殼下腳料，按照料液比lg: 5 ~10mL加入異丙醇，于40~50°C脫脂8~10 h，然后于8000~10000 rpm離心10~15 min除去異丙醇，收集脫脂蟹殼下腳料固形物。
[0009]2)蟹殼下腳料的酶解:將上述脫脂蟹殼下腳料固形物按固液比lg:10~15mL加入磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L, pH 6.5~7.5)，混合液溫度升至45~50°C、超聲處理10~15 min ；然后按脫脂蟹殼下腳料固形物質量的1.0-1.5%加入中性蛋白酶，在45~50°C酶解4~6 h ;將酶解液升溫至90~95°C后恒溫保持10~15 min,酶解液溫度降至50~60°C，按脫脂蟹殼下腳料固形物質量的2.0-2.5%加入木瓜蛋白酶，在50~60°C酶解4~6 h，冷卻至室溫，于9000-10000 rpm離心10~15min，除去沉淀物，得到酶解液。
[0010]3)蟹殼下腳料抗氧化肽鏈的制備:將上述酶解液采用I kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得到超濾酶解液；將超濾酶解液按照體積比加入到裝有6?8倍DA201-C大孔樹脂的層析柱中，用4?5倍柱體積雙蒸水洗脫除去雜質，然后用5?8倍柱體積的70%乙醇進行洗脫，乙醇洗脫液于50 V以下低壓旋蒸除去乙醇、冷凍干燥得多肽混合物，多肽混合物依次經陰離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到蟹殼下腳料抗氧化肽鏈。
[0011]作為優選，所述的步驟I)中的蟹殼，其來源為三疣梭子蟹iPortunustrituberculatus)。
[0012]作為優選，所述步驟3)的陰離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為:
離子交換樹脂層析:將上述多肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為45~50 mg/mL的溶液，經過陰離子交換樹脂(DEAE Sepharose FF)層析柱分離，用水、0.25~0.35 mol/L、和0.45-0.55 mol/L NaCl溶液進行洗脫，根據215 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，對羥基自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解物；
凝膠柱層析:將上述離子交換層析酶解物溶于雙蒸水配成濃度為15~20 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據215 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，具有最高羥基自由基清除活性的峰為凝膠層析酶解物；RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成80~100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化，根據對羥基自由基的清除活性得I個高抗氧化活性多肽Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp (IffMECNW)。
[0013]再優選，所述RP-HPLC條件為:進樣量8~10 μ L ;色譜柱Hypersil BDS C18 (250mmX4.6 mm, 5 μ m);流動相:25%乙腈(含0.1%三氟乙酸)；洗脫速度0.5-0.8 mL/min ;紫外檢測波長215 nm。
[0014]與現有技術相比，本發明所提供的蟹殼下腳料抗氧化肽鏈對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時，Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp(IffMECNW)亦顯示出良好的脂質過氧化抑制作用；IIe-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp(IffMECNW)具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收等優點。
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【附圖說明】
[0016]圖1是本發明的陰離子交換樹脂層析圖；
圖2是本發明的葡聚糖凝膠層析圖；
圖3是本發明葡聚糖凝膠制備酶解物Fr.5-1II的RP-HPLC分析；
圖 4 是本發明 Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp 的質譜圖。
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【具體實施方式】
[0018]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0019]一種蟹殼下腳料抗氧化肽鏈的制備方法，制備工藝流程如下:蟹殼下腳料-脫脂-酶解-酶解物-超濾-大孔樹脂純化-陰離子交換層析-凝膠過濾層析-反相高效液相色譜制備-抗氧化肽。
[0020]具體步驟為:
I)蟹殼下腳料預處理:取過100目篩的三統梭子蟹(ZfertiMiAs trituberculatus')蟹殼下腳料，按照料液比lg: 8mL加入異丙醇，于45°C脫脂8 h，然后于9000 rpm離心10 min除去異丙醇，收集脫脂蟹殼下腳料固形物。
[0021]2)蟹殼下腳料的酶解:將上述脫脂蟹殼下腳料固形物按固液比lg:1OmL加入磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L, pH 7.0)，混合液溫度升至45°C、超聲處理15 min ;然后按脫脂蟹殼下腳料固形物質量的1.2%加入中性蛋白酶，在45 0C酶解5 h ;將酶解液升溫至90 0C后恒溫保持15 min，酶解液溫度降至55°C，按脫脂蟹殼下腳料固形物質量的2.2%加入木瓜蛋白酶，在55°C酶解4 h，冷卻至室溫，于10000 rpm離心lOmin，除去沉淀物，得到酶解液。
[0022]3)蟹殼下腳料抗氧化肽鏈的制備:將上述酶解液采用I kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得到超濾酶解液；將超濾酶解液按照體積比加入到裝有8倍DA201-C大孔樹脂的層析柱中，用5倍柱