用于茶氨酸生產的質粒及其相應工程菌的構建與使用方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因工程領域，具體而言，設及一種用于茶氨酸生產的質粒及其相應 工程菌的構建與使用方法。
【背景技術】
[0002] 茶氨酸化-Theanine)是茶葉中特有的游離氨基酸，屬于酷胺類化合物，學名為 N-乙基-丫-k谷氨酷胺巧-N-eth^-丫-kglutamine)。茶氨酸在化學構造上與腦內活性 物質谷酷胺、谷氨酸相似，是茶葉中生津潤甜的主要成份。
[0003] 茶氨酸主要應用于醫藥和食品領域。在醫藥方面，茶氨酸具有降血壓的作用；與抗 癌藥物共同使用，可W增強抗腫瘤藥物的療效；具有松弛神經緊張和焦慮的作用；能引起 腦內神經遞質的變化，促進大腦的學習和記憶功能，并且能對帕金森癥、傳導神經功能素亂 等疾病起到預防效果；具有改善經期綜合征和減肥的作用；另外，茶氨酸有抗疲勞、提高免 疫力和防御病毒的作用。在食品方面，茶氨酸作為茶飲料的品質改良劑、改善食品風味的添 加劑和功能食品的添加劑。另外，茶氨酸還應用于化妝品中作為保濕劑和皮膚保濕食品等。
[0004] 目前，茶氨酸的合成方法主要有化學合成法和生物轉化合成法。化學合成法反應 過程復雜，副產物多，提取困難，收率較低，安全性差，能耗高且污染大，不適合工業化生產。 生物轉化合成法又可W分為茶樹愈傷組織培養法、酶轉化法合成和微生物轉化法。其中，茶 樹愈傷組織培養法茶氨酸生產量低，產品分離純化過程復雜及生產工藝的控制難度大，運 種植物組織細胞培養法本身也還只在試驗研究階段。酶轉化法合成是從微生物中提取酶， 用酶提取液作為催化劑，催化底物一步轉化生成茶氨酸，此法可W實現酶與底物充分接觸， 轉化周期短，但酶極其不穩定，無法制成純品再加入到合成反應器中，且無法回收利用。
[0005] 微生物轉化法是用完整的微生物細胞將底物一步轉化為茶氨酸，此法的實質和酶 轉化法合成一樣是利用微生物體內的裂和酶或轉胺酶來進行轉化底物，微生物發酵法生產 的茶氨酸具有成本低、容易從反應液中提取獲得產物、轉化效率高、可大量生產的特點，因 此，采用微生物發酵是實現茶氨酸規模化生產的必由之路。
[0006] 近年來，有學者篩選高活性產茶氨酸的微生物菌株進行生產茶氨酸，但由于酶活 較低，茶氨酸的產量很低。此外，很多用于構建基因工程菌的質粒還存在表達效率低、不夠 穩定的缺點。同時，也有學者利用基因工程技術構建表達關鍵酶的重組菌通過微生物轉化 法生產茶氨酸，但大多數克隆的是T-谷氨酷基轉膚酶，催化的底物是谷氨酷胺和乙胺，底 物成本較高，不利于工業化生產。
[0007] 有鑒于此，特提出本發明。
【發明內容】
[0008] 本發明的第一目的在于提供一種丫 -谷氨酷甲胺合成酶的大腸桿菌表達質粒，所 述的質粒在大腸桿菌中表達效率高，其中的丫-谷氨酷甲胺合成酶基因表達出的丫-谷氨 酷甲胺合成酶本身活性就很高，可解決現有的用于茶氨酸的酶活性低下的問題；而且其催 化的底物為低成本的谷氨酸和乙胺，可解決現有技術底物成本較高的問題。
[0009] 本發明的第二目的在于提供一種丫-谷氨酷甲胺合成酶的大腸桿菌表達質粒的 構建方法，該構建方法可對T-谷氨酷甲胺合成酶的原始序列進行優化，可解決現有技術 所用質粒表達效率低的問題。
[0010] 本發明的第=目的在于提供茶氨酸基因工程菌，該基因工程菌由丫-谷氨酷甲胺 合成酶的大腸桿菌表達質粒轉化得到，可用于生產茶氨酸，且該基因工程菌易于培養，可解 決現有菌株不夠穩定的缺點。
[0011] 本發明的第四目的在于提供一種茶氨酸基因工程菌用于生產心茶氨酸的方法， 該方法簡單易行。
[0012] 為了實現本發明的上述目的，特采用W下技術方案：
[0013] 一種丫-谷氨酷甲胺合成酶的大腸桿菌表達質粒，所述表達質粒上的所述丫-谷 氨酷甲胺合成酶的堿基序列為SEQIDNO: 1所示。
[0014] 本申請所采用的丫-谷氨酷甲胺合成酶為對Meth^ovorusmaysNO. 9來源的 GenBankAccession號為AB333782.1的丫-谷氨酷甲胺合成酶基因原始序列進行優化得 來，該酶可將谷氨酸和乙胺催化生成k茶氨酸，催化效率高，且底物性價比高，可有效降低 成本。
[0015] 一種如上所述的丫-谷氨酷甲胺合成酶的大腸桿菌表達質粒的構建方法，包括W 下步驟：
[001引 1)、針對大腸桿菌表達系統對Meth}dovo;rusmaysNO. 9來源的GenBank Accession號為AB333782. 1的丫-谷氨酷甲胺合成酶基因原始序列進行優化，將原始序列 中的低頻密碼子轉換為同義的大腸桿菌高頻密碼子，將原序列中的終止子替換成TAAT強 終止子，在原序列兩端添加上了限制性內切酶的酶切位點，得到優化的gmas基因序列；
[0017]2)、W優化的卵as基因序列為模板，合成堿基序列為SEQIDNO: 1所示的卵as基 因片段；
[0018]3)、將所述優化的gmas基因片段連接到原核表達載體上，得到丫-谷氨酷甲胺合 成酶的大腸桿菌表達質粒。
[0019] 密碼子總計有64種，但實際最終對應翻譯的目的氨基酸種類只有20種，運就意味 著，存在某些多個密碼子編碼同一種氨基酸的現象，也稱做密碼子的簡并性。正是由于該特 性，每個氨基酸至少對應1種密碼子，最多可W有一種氨基酸對應6種密碼子。但運些編碼 相同氨基酸的不同密碼子，在不同物種、不同生物體中使用的頻率并非完全地平均分布，也 即絕大多數生物傾向于只利用運些密碼子中的一部分，該現象也稱密碼子的偏好性。其中 那些被最頻繁利用的密碼子稱為高頻密碼子，而那些不被經常利用的密碼子稱為低頻密碼 子。為了能讓Meth^ovorusmaysNO. 9來源的基因在大腸桿菌表達系統中高效表達，本申 請對其原始密碼子進行了優化，將原始序列中的低頻密碼子轉換為同義的大腸桿菌高頻密 碼子。
[0020] 針對原基因中終止子終止翻譯效率不高的特點，本申請優選將其密碼子替換為 TAAT強終止子，使用強終止子可W使核糖體在翻譯完成后更快更有效地從模板上脫離，一 方面可進一步提高轉錄效率，另一方面也可W避免無功能的過長的蛋白的合成。
[0021]如上所述的丫-谷氨酷甲胺合成酶的大腸桿菌表達質粒的構建方法，步驟3)的具 體步驟為：
[0022] 將所述的gmas基因片段連接到克隆載體上，得到克隆載體-gmas;
[0023] 對克隆載體-gmas進行擴增；
[0024] 根據設計的酶切位點，將gmas基因片段從克隆載體-gmas上酶切下來，連接到經 過相同限制性內切酶切割的表達載體上，構建獲得的重組載體即為丫-谷氨酷甲胺合成酶 的大腸桿菌表達質粒。
[0025]本申請先將目的片段連接到克隆載體上，再酶切并與表達載體連接。此操作有主 要兩方面的原因：
[0026] 進克隆載體比進表達載體容易很多，可W盡快拿到目的片段，一旦克隆不成功，或 者因為Taq酶的錯配出現了堿基突變，會需要重復幾次，樣本即耗材都會大量消耗；
[0027] 克隆載體的最大優點是它一般都有成熟的篩選系統，運樣在一些連接效率較低、 特異性不強的時候容易篩選。
[0028] 如上所述的丫 -谷氨酷甲胺合成酶的大腸桿菌表達質粒的構建方法：
[0029] 所述克隆載體為pU巧7;
[0030] 所述表達載體為祀T-32a。
[0031]pET-32a便于原核表達，并且表達的蛋白具有tag,便于純化。
[0032] 一種茶氨酸基因工程菌，所述茶氨酸基因工程菌是由上述的質粒轉化至大腸桿菌 表達菌株中所得到。
[0033] 優選的，所述大腸桿菌表達菌株為Transetta。
[0034]Transetta可補充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子（AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA) 對應的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系統中的表達水平。
[0035] -種如上所述的茶氨酸基因工程菌用于生產k茶氨酸的方法，包括如下步驟：
[0036] 1)、將所述基因工程菌進行接種于含有所述工程菌所轉入的所述質粒具有抗性對 應的抗生素的LB固體選擇培養基上進行篩選培養，篩選出抗性菌株；
[0037] 2)、將所述抗性菌株進行誘導培養，W誘導gmas基因表達；在所述培養過程中，用 SDS-PAGE方法檢測丫-谷氨酷甲胺合成酶的表達情況，檢測合格后通過低溫離屯、所述發酵 培養基獲得濕菌體；
[0038] 3)、利用所述濕菌體在生物轉化反應體系中進行催化底物生成k茶氨酸。
[0039] 優選的，在步驟1)中，所述篩選培養的培養條件為：
[0040] 36~38°C恒溫倒置培養12~16h。
[0041] 優選的，在步驟2)中，所述誘導培養的具體培養過程為：
[0042] 將步驟1)中篩選出的抗性菌株接種于含與所述質粒具有抗性對應的抗生素的L