一種利用dna非特異性結合蛋白hu蛋白構建克隆載體的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，設及一種利用非特異性DNA結合蛋白構建克隆載 體的方法，尤其設及一種利用含有和DNA非特異性結合的蛋白皿取代重組酶，在大腸桿菌 中連接DNA片段和克隆載體構建的方法。
【背景技術】
[0002]DNA克隆是應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質一同源或異源、原核或 真核、天然或人工的DNA與載體DNA相結合成一具有自我復制能力的DNA分子一復制子，繼 而通過轉化或轉染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增、提取獲得大 量同一DNA分子。它是分子生物學的重要內容。傳統DNA克隆方法是利用酶切連接的方法， 但該方法步驟多且繁瑣費時。
[0003] 同源重組是生物界普遍存在的生理現象，是發生在同一染色體等染色體上含有同 源序列的DNA分子之間或分子之內的重新組合，同源重組需要一系列的蛋白質催化，如原 核生物細胞內的RecA、RecF等，W及真核生物細胞內的Rad51、化ell-Rad50等等；同源重 組反應嚴格依賴DNA分子之間的同源性。近年來，W同源重組原理為基礎的同源重組克隆 法受到越來越多的重視，該方法不受載體和目的片段的酶切位點限制，依賴于兩者之間的 同源序列，并且通過重組酶直接完成目的片段與載體的連接和克隆。該技術操作簡單，PCR 產物一步定向克隆，目的片段與載體無縫連接，反應時間短，但是重組酶純化的過程比較復 雜，運送和保存方法要求也比較高，因此成本較高。
[0004] 皿是與DNA非特異結合的類似組蛋白的耐熱的小分子蛋白質。皿是由兩個同源 亞基化pA和化地組成，是最保守的核酸結合蛋白，可非特異性結合雙鏈DNA，也有發現其對 于缺口和彎曲的DNA有特定偏好。皿蛋白不但能像結合單鏈DNA的SSB蛋白一樣與單鏈 DNA結合，同時還能結合雙鏈的DNA。而來源于大腸桿菌菌株U93的組蛋白樣蛋白（皿)，作 為一種與DNA非特異性結合的蛋白，在細菌染色體的壓縮和排列過程中扮演了重要角色。 它除了維持DNA的超螺旋和壓縮狀態外，還能對DNA的結構起到一些特殊作用，如DNA的彎 曲、基因轉錄調控、起始于復制原點的復制、核蛋白復合物在裝配時所需的位點特異性重組 反應，W及通過蛋白質-RNA相互作用控制的翻譯起始等。 陽0化]同源重組克隆法是利用重組酶來進行連接DNA和克隆的，迄今為止國內國外，沒 有任何有關利用同DNA非特異性結合的蛋白代替克隆所需要的酶在大腸桿菌中進行定向 克隆載體構建的報道。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種利用非特異性DNA結合蛋白皿蛋白構建克隆載體的 方法。
[0007] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0008] 一種利用DM非特異性結合蛋白皿蛋白構建克隆載體的方法，具體通過w下步驟 完成：
[0009] (1)對至少兩個待連接的DNA片段設計引物；
[0010] (2)根據酶切或者PCR反應得到待連接的線性化載體； W11] 做對上述至少兩個待連接的DNA片段之間引入DNA同源同組序列； 陽〇1引 （4)利用皿蛋白進行同源重組轉化；
[0013] (5)在大腸桿菌中進行轉化和克隆，得到重組DNA質粒。
[0014] 進一步，步驟（1)中所述的待連接的DNA片段包含用于克隆的線性化質粒片段。 [001引進一步，步驟似的具體步驟為根據限制性酶切或PCR反應得到待連接的線性化 載體的兩端序列，通過PCR反應得到與線性化載體的5'和3'末端具有15到50同源堿基 的目的DNA片段。
[0016] 進一步，步驟（4)的反應條件是將待連接的DNA片段、Shiftbuffer和皿蛋白混 合成lOul體系，混勻后離屯、，常溫反應8分鐘；Shiftbuffer的配方：25mMTrisP冊.0和 lOmMMgClz。
[0017] 進一步，步驟妨使用D冊a或top 10或DHIOB感受態細胞進行轉化。
[0018] 采用上述方案后，本發明方法通過對待連接的DNA片段設計引物，并引入DNA同源 同組序列，再分別進行擴增，擴增產物和皿混合，利用傳統的轉化方法在大腸桿菌中進行 轉化和克隆，得到重組DNA質粒。本發明方法不依賴于任何重組酶，不受載體和目的片段的 酶切位點限制，用同源重組的方法和皿蛋白一起完成目的片段與載體相連接的基因克隆 技術。本發明的有益效果為：操作簡單，PCR產物一步定向克隆，目的片段與載體同源重組 連接，常溫反應時間短至10或15min，陽性率高達95%W上。
【附圖說明】
[0019] 圖1是本發明中皿蛋白SDS-PAGE電泳檢測圖；
[0020] 圖2是本發明中皿蛋白條帶遷移活性檢測圖；
[0021] 圖3是本發明中皿蛋白取代市售重組酶進行重組轉化結果圖；
[0022] 圖4是本發明中皿蛋白對市售重組酶重組效率影響效果圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明，W下所述，僅是對本發明的較佳實施 例而已，并非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述掲示 的技術內容加W變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明 的技術實質對W下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發明的保護范圍內。
[0024] 實施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規試劑和使用常規方法。 陽02引實施例1 :非特異性DNA結合蛋白皿蛋白的制備 陽0%] 1)將來源于大腸桿菌U93的皿-a或皿-P亞基或者是皿-a和皿-P的二聚體 分別插入祀T22表達載體中，通過連接轉化并用菌落PCR、酶切鑒定及測序驗證，即可得到 重組表達載體祀了22-化-〇或者祀了22-化-6或者是化-〇和化-6的二聚體； W27]。使用大腸桿菌感受態細胞化21對構建好的重組載體祀T22-HU-a或者 PET22-HU-P或者是皿-a和皿-P的二聚體進行轉化，之后取含重組質粒的陽性菌株并 加入LB液體培養基中培養過夜，之后菌液按體積比1 %接種到50ml的LB培養液中，放入 37°C搖床培養至其OD值為0. 6-0.8 ;然后加入IPTG，并放入37°C搖床中誘導表達3.化，搖 床轉速為160巧m\min。 陽02引扣取誘導表達后的菌液離屯、得到菌體，裂解，釋放蛋白質，并通過SDS-PAGE電泳 檢測蛋白表達情況，結果如圖1(圖1中：M是蛋白分子量Marker;M左側為待檢測蛋白的電 泳條帶）所示的蛋白為水溶性的、且大小正確即10. 5kDa，從而篩選到所釋放的蛋白為水溶 性且大小正確的陽性菌株即所需陽性菌株；
[0029] 4)利用上述操作2)與3)的操作培養獲得大量所需陽性菌株，菌液經3000Xg離 屯、15min，收集大腸桿菌菌體，于-70°C冷凍放置過夜，備用；將收集到的大腸桿菌菌體懸浮 在裂解緩沖液（組分為：〇. 05MTris、0. 2M氯化鋼、0. 01M邸TA、10%V/v甘油、pH7. 5)，冰 上超聲裂解菌體，裂解液經27000Xg離屯、15min，于上清液中加入體積比10%的陽I至其 終濃度為0. 35% (體積比）和終濃度0. 75M的化C1，4°C放置至核酸沉淀，之后17000Xg離 屯、20min，于上清液中添加飽和硫酸錠至其體積分數為50%，在4°C放置比，接著17000Xg 離屯、15min，去沉淀，上清液中加入硫酸錠至完全飽和，然后17000Xg離屯、30min，取硫酸錠 沉淀溶解在緩沖液（組分：〇. 02MTris、0. 001M邸TA、0. 1M化Cl、10%V/v甘油、pH7. 5)， 透析36h，換液S次；透析后的溶液上樣至強陽離子交換柱，用透析緩沖液化Cl梯度洗脫， 收集0. 2M和0. 25M的化C1洗脫峰，并W弱陽離子交換柱及0. 25M化C1梯度洗脫該洗脫 峰，得到皿蛋白原液，將皿蛋白原液于85°C下加熱20min后W轉速14000Xg，4°C下離屯、 20min，取上清液即得非特異性DNA結合蛋白皿蛋白。加入甘油至其體積分數為50%，-70°C 保存待用。
[0030] 其中，強陽離子交換柱采用SP瓊脂糖凝膠柱，弱陽離子交換柱采用1CM-瓊脂糖 柱。
[003U 將洗脫后所得的皿蛋白原液即非特異性DM結合蛋白進行SDS-PA(iE分析，結果 為大小約為10. 5kDa，純度為95%左右，即皿蛋白原液的濃度為：130ng/y1。 陽03引實施例2出U蛋白的活性檢測 陽03引本化ift實驗是用來測定皿蛋白與DNA結合的活性。在相同量的質粒pET-2化巧439bp, 16ng/ul)中加入不同量的皿蛋白進行shift實驗具體過程如下：
[0034] 瓊脂糖凝膠阻滯實驗（shift實驗），如表1所示確定好梯度，將質粒祀T-2化與 shift buffer (20mM Tris-肥1，調抑7. 5, ImM邸TA ;混勻）、皿蛋白130ng/ul混合成lOul 體系。混勻后離屯、，室溫放置8min。
[0035]表1 pET-22b與shift buffer、皿130ng/ul混合體系
[0036]
[0037] 反應完成后，加入化1DNA6X loadingbuffer混勻，使用1% (W/V)瓊脂糖凝膠進 行電泳，上樣量為加1。
[0038] 電泳結果如圖2所示，圖2中各甫道表示如下，M:DNA分子量Marker;1 :環狀DNA 模板燈）與shiftbuffer(SB)混合液；2 :T與SB混合液體系內加入0. 2y1皿蛋白原液 (稀釋5倍）；3 :T與SB混合液體系內加入2y1皿蛋白原液（稀釋5倍）；4 :T與SB混 合液體系內加入1y1皿蛋白原液；5 :T與SB混合液體系內加入1. 8y1皿蛋白原液；6 : T與SB混合液體系內加入2y1皿蛋白原液；7 :T與SB混合液體系內加入2. 5y1皿蛋白 原液；8 :T與SB混合液體系內加入3y1皿蛋白原液；9 :T與SB混合液體系內加入3. 5y1 皿蛋白原液；10 :T與SB混合液體系內加入4yl皿蛋白原液；11 :T與SB混合液體系內加 入4. 5y1皿蛋白原液；12 :T與SB混合液體系內加入5y1皿蛋白原液），由圖2可見在 加入皿蛋白后，皿蛋白與環狀的雙鏈DNA結合，隨著皿蛋白加入量的增加，DNA條帶逐漸 上移，表明本發明制備的皿蛋白有活性并且與環狀的雙鏈DNA相互作用。
[0039] 實施例3 :皿蛋白對同源重組效率的影響
[0040] 本實施例是在待連接的DNA片段中加入不同量的皿蛋白后，在大腸桿菌中轉化和 克隆的結果（菌落生長情況），W及市場上購買的同源重組試劑盒的菌落生長情況。克隆的 效率用傳統的克隆PCR法來驗證。轉化和克隆具體過程如下：
[0041] 克隆載體構建過程（W線性載體PUC19和DNA片段A重組質粒為例）；pUC19線性 載體的DNA序列如序列表中SEQIDNO. 1所示，DNA片段A的序列如序列表中SEQIDNO. 2 所示。
[0042] 1.線性載體準備
[0043] 1. 1.對pUC19質粒進行PCR擴增
[0044] 1. 1.lpUC19PCR引物設計與訂購
[0045] 引物1 (pucl9-正引物）的DNA序列：ctctagagtcgacct(如序列表中沈QIDNO. 5 所示）；此序列是pUC19序列位置422到436的15個堿基。
[0046] 引物2(pucl9-反引物）的DNA序列：taccgagctcgaatt(如序列表中沈QIDNO. 6 所示）；此序列是pUC19序列位置411到397的15個堿基。
[0047] 引物訂購（英濰捷基引物訂購公司）
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