利用miR397a提高植物中酚類化合物含量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因工程技術領域和遺傳育種領域，具體地說，設及一種利用miR397a 提高植物中酪類化合物含量的方法。
【背景技術】
[0002] 丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參（SalviamiItiorrhizaBunge)的干燥根及根 莖，具有活血調經、桂疲止痛的功效，臨床上可用于屯、腦血管疾病、癌癥及慢性肝炎、尿毒癥 等疾病的治療。目前世界上W丹參為原料的藥品和保健品在市場上所占份額越來越大，如 復方丹參滴丸、復方丹參注射液等近百種產品，已達到數百億元，且1997年復方丹參滴丸 成為第一個向美國FDAW治療藥身份申報的品種，表明丹參首例用國際標準進行評價的傳 統中藥，應用前景十分廣闊。
[0003] 根據化合物的結構特點和理化性質，可W將丹參的化學成分為兩類：一類為脂溶 性的丹參酬類化合物，如丹參酬（Tanshinone)I和丹參酬IIA等；一類為水溶性的酪酸類 化合物，如迷迭香酸和丹酪酸B等。其中，W丹參水溶性物質為主的復方丹參注射液、丹參 素注射液等制劑越來越受到人們的歡迎。其中，丹參水溶性藥用成分中W丹酪酸B的含量 最高，2005年版和2010年版《中華人民共和國藥典》均將丹酪酸B作為丹參藥材質量控制 的指標性成分；迷迭香酸具有抗炎、鎮痛、解痛的功效，在植物中的分布較為廣泛，主要存在 于唇形科、紫草科、葫蘆科等多種植物中，且已經研發成藥物，于1990年在德國投放市場； 原兒茶醒和丹參素在丹參中的含量也較高，具有很強的抗脂質氧化、抗肝纖維化、改善尿毒 癥等作用，二者常作為丹參原藥材W及丹參制劑的質量控制指標成分，也是丹參治療冠屯、 病的主要有效成分。
[0004] 近年來，隨著丹參藥材需求量的迅速增加和野生資源的減少，人工栽培丹參的品 質良莽不齊，因此，如何從分子水平上提高丹參中酪類化合物的含量，培育優質品種已成為 丹參資源開發中新的研究方向。經檢索發現，國內外科學家采用組織培養和細胞工程、非生 物誘導子誘導、基因工程技術等方式對提高丹參酪類物質的含量進行研究。通過組織培養 和細胞工程、非生物誘導子誘導提高的酪類物質含量升幅不大，且隨著繼代次數的增加，含 量逐漸降低，穩定性不高。采用轉基因技術提高丹參中迷迭香酸和丹酪酸B的含量，僅為野 生型丹參干燥根中迷迭香酸和丹酪酸B含量的1. 15和1. 79倍，因此，通過轉基因技術進行 丹參品種的穩定改良還有很大的提升空間。
【發明內容】
陽0化]本發明的目的是提供一種利用miR397a穩定提高植物，特別是丹參中酪類化合物 含量的方法。
[0006] 為了實現本發明目的，本發明首先提供miR397a在提高植物中酪類化合物含量中 的應用。
[0007] 所述應用具體為：在植物中過表達miR397a，獲得酪類化合物含量提高的轉基因 株系。
[0008] 前述的應用，所述植物包括丹參。
[0009] 本發明還提供一種miR397a過表達載體，所述過表達載體上含有由強啟動子驅動 的miR397a基因cDNA序列（SeqIDNo. 1，下劃線為miR397a成熟體序列）。
[0010] 其中，所述過表達載體的出發載體為植物雙元表達載體（優選為地1121)，所述強 啟動子優選為CaMV35S。
[0011] 本發明構建的miR397a過表達載體CaMV35Sp: :miR397a的結構如圖1所示。
[0012] 本發明還提供含有所述過表達載體的工程菌和轉基因細胞系。
[0013] 本發明還提供所述過表達載體在制備轉基因植物中的應用。
[0014] 本發明進一步提供一種利用miR397a提高植物中迷迭香酸和丹酪酸B等酪類化合 物含量的方法，將所述過表達載體轉入植物中獲得酪類化合物含量提高的轉基因植株。其 中，所述植物包括丹參。
[0015] 優選地，利用農桿菌介導的方法將所述過表達載體轉入植物中。采用凍融法將過 表達載體轉化農桿菌，具體步驟如下：
[0016] 1)將GV3101農桿菌感受態細胞置于冰上，待其融化后向管中加入2-6 iiL質粒 CaMV35Sp: :miR397a，使其充分混勻后置于冰上5min，然后再將管放于液氮中速凍5min，完 成后迅速將管放于37°C的金屬浴中熱擊5min;
[0017] 2)完成后將上述混合液加入1血LB液體培養基中，28 °C慢速振蕩2-4h;
[0018] 3)將振蕩后的離屯、管取出，常溫下3000巧m離屯、4min，棄掉一部分上清液，留約 200yL菌液用涂布棒均勻涂在含化f和Kan(濃度分別為200mg/L和50mg/L)的LB固體平 板上，然后倒置放于28°C的恒溫培養箱中培養2地；
[0019] 4)在超凈工作臺中用已滅菌的槍頭從平板上挑選3-6個農桿菌單菌落，分別加入 含LB液體培養及（含Rif和Kan)的離屯、管中，28°C振蕩過夜培養；
[0020] 5)用移液器將農桿菌菌液吸取ImL加入1. 5mL干凈的離屯、管中，然后再向其中加 入已滅菌的0. 5mL甘油（濃度為50% )，充分混勻后保存于-80°C冰箱，用于后續植物轉化 實驗。
[0021] miR397a是microRNA的一種，為長度21bp的內源性非編碼RNA，在植物進化中高 度保守，具有重要的調控功能。丹參具有基因組小，染色體少，生長條件簡單，且已經初步完 成基因組測序等特點，正在發展成為潛在的模式藥用植物，因此miR397a在丹參中的作用 研究對其他植物有一定的指導借鑒意義。
[0022] 用質粒CaMV35Sp: :miR397a對丹參進行遺傳轉化，具體方法如下：根據對993品 系丹參轉化體系的摸索，將ODe。。值為0. 5的農桿菌ImL稀釋20倍侵染生長狀態良好的丹 參葉片，侵染時間為5min，在SmTl固體培養基中25°C暗培養2天后，轉入SmT2固體培養基 25°C下光培養1化暗培養化，每10天繼代一次，直到長出小芽，將小芽剪下，轉入SmT3固體 培養基中誘導生根，直至培養成植株。
[0023]其中，SmTl培養基：MS+BAP1.Omg/L+NAA0.Img/L
[0024] SmT2培養基：MS+BAP1. Omg/L+NAA0.Img/L+Cef200mg/L+Kan50mg/L 陽0巧]SmT3培養基：1/2MS+Cef2〇Omg/L
[00%] 前述的方法，用于PCR鑒定轉基因植株的引物組合為：
[0027]miR397a-5F:5' -CGCACAATCCCACTATCCTTCGCAA-3'
[0028] miR397a-5R:5< -CGCTGCACTCAATGATGGTTCTCCA-3'
[0029]miR397a-3F:5' -GCCCAATGGTACCAGACAAGTCAA-3'
[0030]miR397a-3R:5< -CAAGACCGGCAACAGGATTCAATCT-3'
[0031] 利用UFLC-QTrap-MS/MS技術分別測定轉基因植株（例如，轉基因丹參株系）的 根、莖和葉中酪類化合物的含量，結果顯示，與野生型植株相比，酪類化合物在轉基因植株 中的含量較野生型對照植株有不同程度的提高，尤W丹酪酸B和迷迭香酸含量提高程度較 大。
[0032] 本發明通過構建miR397a過表達載體并獲得丹酪酸B和迷迭香酸等酪類化合物含 量提高的轉基因植株（例如，轉基因丹參株系1-7)，為更好地探討miR397a在酪類化合物生 物合成中的功能提供依據，同時也為植物的分子育種及品質成因奠定了理論基礎。
【附圖說明】
[0033] 圖1為本發明實施例1中構建的過表達載體CaMV35Sp: :miR397a的結構示意圖。
[0034] 圖2為本發明實施例3中miR397a轉基因丹參的PCR檢測電泳結果；A圖中M:DNA 分子量標準；P:表達載體目的基因5'端序列的陽性克隆；1-7 :轉基因丹參株系1-7目的基 因的5'端序列；wt:野生型丹參植株陰性對照；B圖中M:DNA分子量標準；P:表達載體目 的基因3'端序列的陽性克隆；1-7 :轉基因丹參株系1-7目的基因的3'端序列；wt:野生型 丹參植株陰性對照。 陽03引圖3為本發明實施例4中miR397a在轉基因丹參葉中的表達；其中，橫坐標1-7為miR397a轉基因丹參的7個株系，wt為野生丹參；縱坐標為相對表達量。
[0036] 圖4為本發明實施例5中丹參素、迷迭香酸、原兒茶醒、丹酪酸A和丹酪酸B對照 品的總離子流圖；其中，橫坐標為出峰時間，縱坐標為峰高。
[0037] 圖5A-圖