對河流弧菌o11，o14,o16和o17特異的核苷酸及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及對河流弧菌011，014, 016和017血清型特異的核巧酸，尤其設及對河 流弧菌011，014, 016和017血清型0抗原基因簇中單個基因特異的核巧酸及其應用。
【背景技術】
[0002] 河流弧菌為革蘭氏陰性菌，是海洋環境的主要棲息菌之一，廣泛存在于河流和出 海口環境水域，也是人類與水生生物主要的細菌性病原之一，可W起魚、郵、貝等多種養殖 動物的疾病，給養殖業帶來嚴重的經濟損失。河流弧菌還可W通過各種食物導致人類嚴重 的流行性腹瀉，是弧菌屬中僅次于霍亂弧菌和副溶血弧菌的致病性弧菌，被認為是一種全 球性的人獸共患的新型病原菌。它的分型與鑒定是海洋菌種庫建立的重要前提之一。
[0003] 細菌分型與鑒定方法主要有傳統的表型方法、血清學方法W及分子鑒定方法。然 而，隨著分子生物學的發展，傳統的血清分型和鑒定方法存在著一定的問題，如血清分型運 種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類不全，數量不足，大量的抗血清在制備和 儲存中也存在一些困難。另一方面血清分型方法耗時長、靈敏度低、漏檢率高、準確性差，不 同的0抗原產生的抗血清之間經常存在交叉反應。因此，建立基于分子生物學技術的血清 鑒定方法成為發展方向。
[0004] 河流弧菌的分子鑒定越來越受到人們的重視，成為河流弧菌菌種與株型鑒定的重 要依據，不少新菌也因此產生。對弧菌而言，生化反應主要是各種酶譜的表現，屬于外部形 態的內容，核酸的相似性才是弧菌種的界定最根本、最直接的特征。因此，河流弧菌的分型 與鑒定最有效、最直接的方式應該從核酸的研究觸發，通過比較核酸(包括基因組與核酸片 段）的相似性確定河流弧菌的歸屬。
[0005] 近年來，越來越多的分子技術用于病原菌的分型、鑒定、檢測及病害診斷，包括轉 錄間隔區（口巧序列分析、隨機擴增長度多態性（RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長度 多態性（RFL巧分析等。分子生物學方法不僅可用于河流弧菌的快速血清分型篩查，穩定的 鑒定結果可W彌補表型特征鑒定方法的不足。和傳統檢測技術相比，運些基于多聚酶鏈式 反應（PCR)的分子檢測技術，不需要經過病原菌的分離、純培養等過程，而且具有快速、靈 敏、特異性強等優點。
[0006] 聚合酶鏈式反應技術（Polymerasechainreaction,簡稱PCR技術）作為微生物 檢測技術目前正在得到認同和推廣，該技術相對于傳統的方法有高通量、檢測速度快、特異 性強、靈敏度高等優點，只需對樣品進行簡單的預增菌或增菌過程，再通過離屯、及裂解制備 細菌DNA模板，就可W在高特異性引物介導下的PCR過程中擴增目標序列，達到檢測樣品中 是否含有待測的致病性微生物的目的。PCR的擴增過程僅需1個半小時。運對檢驗檢疫部 口和臨床檢驗無疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。
[0007] 不論從國內和國際的角度來看，快速、準確地鑒定出血清類型，為河流弧菌的防控 提供有效技術支持是十分重要的。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于提供了本發明設及對河流弧菌011，014, 016和017血清型特異 的核巧酸，其特征在于所述的核巧酸具有： 1) 沈QIDNO: 1-8所示的核巧酸中的至少一種； 2) 與SEQIDNO: 1-8所示的核巧酸互補的核巧酸中的至少一種；所述的SEQIDNO: 1-8 如下：
本發明還提供了一種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DM聚合酶，所述PCR引物為如SEQIDNO: 1-12所示的核巧酸中的至少一種。所述的試劑盒，還包括如下試劑： 10mldNTP30y1 ; 10X酶特異性反應緩沖液50y1 ;5U/y1耐熱DNA聚合酶5y1 ;引物 混合物10y1 ;陽性對照品10y1;陰性對照品10y1 ;d地2〇 5ml。
[0009] 其中所述的PCR引物優選為所述如SEQIDNO: 1-8所示的核巧酸中的至少一種。
[0010] 本發明進一步公開了對河流弧菌011，014,016和017血清型特異的SEQID NO: 1-8核巧酸在制備用于檢測河流弧菌河流弧菌011，014, 016和017血清型的PCR試劑 盒、基因忍片或微陣列方面的應用。
[0011] 本發明所述河流弧菌可W取樣于自來水、河流水、海水的培養物的粗提液，或是河 流弧菌的純培養物的粗提液等。
[0012] 收集河流弧菌提取基因組是采用常規方法制備獲得。
[0013] 針對河流弧菌的PCR試劑盒，整個檢測步驟包括樣品預處理一擴增一電泳檢測結 果。引物和PCR反應體系所需要的試劑已預先加入擴增管中，使用者只需將預處理后的樣 本加入擴增管啟動擴增反應即可，簡單快速的完成檢測工作。
[0014] 本發明還提供一種基因忍片，包括固相載體和固定在固相載體上的寡核巧酸探 針，其中所述寡核巧酸探針包括上述的核巧酸；其中所述核巧酸優選為如SEQIDNO: 1-8所 示的核巧酸。
[0015] 本發明還提供一種微列陣，其包括上述的核巧酸；其中所述核巧酸優選為如SEQ IDNO: 1-8所示的核巧酸。
[0016] 本發明進一步公開了對河流弧菌011,014, 016和017血清型特異的核巧酸在制備 用于檢測河流弧菌PCR試劑盒方面的應用。在制備用于檢測河流弧菌的基因忍片方面的應 用。在制備用于檢測河流弧菌微陣列方面的應用。所述的檢測河流弧菌指的是檢測引起嚴 重腹瀉，敗血病，小腸結腸炎，腦膜炎，眼內炎，海洋生物感染的細菌。
[0017] 本發明公開的對河流弧菌011,014, 016和017血清型特異的核巧酸與現有技術相 比，本發明具有如下優點： (1)實用性強 本發明建立的一種PCR反應體系，可檢測河流弧菌，提供血清分型檢測所用到的特異 引物，利用該PCR方法可W對臨床標本進行檢測。
[001引 （2)準確性高 本發明通過對河流弧菌的各血清型特異的基因的PCR反應，每個樣品得到一條目的條 帶，將得到目的片段與已知長度相比較，就可W得到河流弧菌所屬的血清型。
[0019] (3)檢測成本相對較低 可W推廣應用于食品衛生監督、環境監測、尚品監測檢驗檢疫等領域，并為其他不同致 病菌檢測組合提供技術模式。
[0020]
【附圖說明】： 圖1表示本發明011血清型r。基因P1和P2引物檢測河流弧菌其他血清型標準菌株 電泳結果圖，rzf蓋嫁尸化新W巧I物的篩選，目的條帶為i〇9bp，其余的血清型沒有任何條 帶，具體菌株信息見表2; 圖2表示本發明011血清型蓋嫁W游化引物種特異性的鑒定電泳結果圖，其中 用蓋嫁W游化引物檢測了6株弧菌W及1株沙口菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶，具 體菌株信息見表2 ; 圖3表示本發明014血清型WZY基因P3和P4引物檢測河流弧菌其他血清型標準菌株 電泳結果圖，WZY基因P7和P8引物的篩選，目的條帶為10化P，其余的血清型沒有任何條 帶。具體菌株信息見表2 圖4表示本發明014血清型WZY基因P3和P4引物種特異性的鑒定電泳結果圖，其中 檢測了 6株弧菌W及1株沙口菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶。具體菌株信息見表2。
[0021] 圖5表示本發明016血清型WZY基因P5和P6引物檢測河流弧菌其他血清型標準 菌株電泳結果圖，WZY基因P5和P6引物的篩選，目的條帶為l(K)bp，其余的血清型沒有任何 條帶，具體菌株信息見表2; 圖6表示本發明016血清型WZY基因P5和P6引物種特異性的鑒定電泳結果圖，其中 用WZY基因P5和P6引物檢測了 6株弧菌W及1株沙口菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶，具 體菌株信息見表2 ; 圖7表示本發明017血清型WZY基因P7和P8引物檢測河流弧菌其他血清型標準菌株 電泳結果圖，WZY基因P7和P8引物的篩選，目的條帶為114bp，其余的血清型沒有任何條 帶，具體菌株信息見表2; 圖8表示本發明017血清型蓋嫁尸7游化引物種特異性的鑒定電泳結果圖，其中 用蓋嫁游W巧I物檢測了 6株弧菌W及1株沙口菌、1株大腸桿菌，均無任何條帶， 具體菌株信息見表2 ; 圖9表示分別用011，014, 016和017特異引物擴增對應血清型的電泳結果圖，具體菌 株信息見表2 ; 其中：011，014, 016和017和負對照（-)表示相應血清型引物擴增結果，第一個泳道H和最后一個泳道是2000bpladdermarker。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解運些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊（NewYork:ColdSpringHarborL油oratory Press, 1989)中所述的條件。其中河流弧菌來源于JapanCollectionofMicroorganisms (JCM)o
[0023]連施例1:基閑紀的提取 37°C營養肉湯培養基培養河流弧菌，收集細菌，提取基因組具體步驟如下： 用500ul50mMTris-肥l(p冊.0)和lOul0. 4M邸TA重懸細胞，37°C溫育20分鐘，然 后加入lOullOmg/ml的溶菌酶繼續保溫20分鐘。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS，50°C溫育2小時，再加入3ullOmg/ml的RNase，65°C溫育30分鐘。加等體積酪 抽提混合物，取上清液，再用等體積的酪：氯仿：異戊醇（25 :24 :1)溶液抽提兩次，取上清 液，再用等體積的乙酸抽提W除去殘余的酪。上清液用2倍體積乙醇沉淀DNA，用玻璃絲卷 出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后將DNA重懸于30ulTE中。基因組DNA通過0. 4%的瓊脂 糖凝膠電泳檢測。
[0024]連施例2:序列破譯 提取河流弧菌011，014, 016和017血清型標準菌株的基因組，通過Solexapair-end測 序技術對河流弧菌各個血清型基因組進行全基因組測序獲得該血清型的序列，運用Blast 及PSI-Blast進行序列比對，采用TMHMM2. 0program進行跨膜結構預測，運用ClustalW program進行序列對齊及篩選保守和特定基因片段，最終獲得河流弧菌各個血清型的0抗 原基因簇序列及破譯結果。
[0025]連施例3:引物巧計 河流弧菌011，014, 016和017各個血清型的0抗原基因簇序列是本實驗室自測的，通 過比對分析，我們選取Blast比對結果identity和similarity值相對較低的基因特異區 段設計引物。其中011血清型r巧基因比對結果identity值和similarity值為48%和 70% ;014血清型的r巧基因比對結