海洋鏈霉菌環二肽及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及環二膚，尤其是設及海洋鏈霉菌環二膚及其制備方法。
【背景技術】 W02] 環二膚，又稱為2, 5-二酬贓嗦，2, 5-二氧贓嗦，或二膚酸酢，由兩個氨基酸 通過膚鍵環形成，其典型結構中包含一個二酬贓嗦。環二膚具有特別穩定的六元環結 構和構象約束作用，運一結構在藥物化學研究中是一類重要的藥效團（[l]Mcdowell RS,GadekTR.StructuralstudiesofpotentconstrainedRGDpeptides[J].JAm 化emSoc，1992, 114(24) :9245 ;[2]趙喜梅.環二膚與一價金屬離子的相互作用識別研 究巧].鄭州：鄭州大學，2010:85.)。環二膚來源很廣，有些是動植物中生來就有的， 有些是通過發酵或者在食品加工過程中產生的。環二膚被發現普遍存在于蛋白及多膚 水解物，W及動植物、酵母、原生生物、真菌、海洋生物中。由于來源不同，環二膚的生物 活性也不同，目前發現的環二膚因其較強的生物活性而被人們廣泛關注，例如，環二膚具 有影響胞間信息傳遞、抑制毒素、促進癌細胞調亡、鎮痛、抑制致病微生物等作用（[3]強 薇，梅剛.真菌中環二膚及其衍生物的抗腫瘤活性研究進展[J].長沙：中南大學藥學 院，2014. 25(21) :2007-2009 ; [4]盧犧元，徐德昌.環二膚生物活性的研究進展[J].生物 信息學，2011，9(4) : 289-291.)。
[0003] 由于海洋環境存在低溫、高壓、寡營養、高鹽等特點，使海洋微生物可能產生出結 構新穎多樣、活性獨特的天然產物，因此引起了許多科學家的關注。目前已經從海洋細菌、 海洋放線菌、海洋真菌、紅樹林葉內生真菌的代謝產物中已分離出大量的具有生物活性的 環二膚類化合物。
[0004] 目前國內外研究機構大多通過有機溶劑萃取、凝膠柱層析、一系列正相和反相色 譜柱和高效液相色譜等現代分離技術來分離環二膚類化合物（[引宮俊，湯華，耿婉麗， 劉寶妹，孫鵬，李玲，李志勇，張文.仿刺參共附生放線菌化evibacteriumsp.中的環 二膚成分的分離和鑒定[J].第二軍醫大學學報，2012, 33 (12) : 1284-1287)。
【發明內容】
陽0化]本發明的目的在于提供一種鏈霉菌（Str巧tomycessp. )HNS054。
[0006] 本發明的第二目的在于提供兩種海洋鏈霉菌環二膚及其制備方法。
[0007] 本發明的第=目的在于提供兩種海洋鏈霉菌環二膚的應用。
[0008] 所述鏈霉菌（Streptomycessp. )HNS054已于2014年03月20日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學 院微生物研究所，郵編：1〇〇1〇1，保藏中屯、登記入冊編號：CGMCCNo. 8946。
[0009] 所述兩種海洋鏈霉菌環二膚分別是環（脯-酪）二膚和環（脯-鄉）二膚。
[0010] 所述兩種海洋鏈霉菌環二膚的制備方法如下：
[0011] 1)獲得膚類粗提物，具體方法為：
[0012] 先發酵海洋鏈霉菌，得海洋鏈霉菌發酵液，再通過連續流離屯、，錯流過濾，5K濾膜 切向流過濾，得發酵液上清，發酵液上清經大孔樹脂吸附和解吸附獲得膚類粗提物；將膚類 粗提物經旋轉蒸發濃縮后直接進行純化，或再經冷凍干燥W粉末狀態避光低溫長期保存；
[0013] 2)經乙臘-水濃度梯度反相HPLC制備，獲得多個組分，再經旋轉蒸發濃縮后直接 進行純化，或再經冷凍干燥W粉末狀態避光低溫長期保存；
[0014] 3)將各組分通過乙臘-水等度反相HPLC分離獲得純膚，經旋轉蒸發和冷凍干燥后 W粉末狀態避光低溫長期保存。
[0015] 在步驟1)中，所述發酵海洋鏈霉菌所用的培養基可為2216E培養基，2216E培養基 的配方為：蛋白腺5g，酵母膏Ig，憐酸高鐵0.Olg，瓊脂：15~20g，抑：7. 4~7. 5,無菌海水 1000ml，高壓蒸汽滅菌：12rC，20min;發酵的條件為：28°C，165rmp，9化；
[0016] 所述切向流過濾可采用PA化Centramate超濾系統，先用MWC0300K膜包濾去大分 子，濾過液再用MWC05K膜包濾過小分子蛋白/膚類；需要注意的是膜包標稱的濾過或截留 孔徑大小要經過實驗驗證，標稱10K的膜包在實際中會濾過部分10~20K的蛋白；
[0017] 所述大孔樹脂可采用型號為NKA-9的大孔樹脂，可采用鄭州勤實科技有限公司產 品；
[0018] 所述大孔樹脂吸附和解吸附的流程是：將處理好的大孔樹脂W1 : (3~20)體 積比與切向流濾過液混合，4°C下，通過搖床、磁力攬拌、機械攬拌等方式連續攬拌10~ 1地，之后用去離子水漂洗大孔樹脂5次W上，將大孔樹脂裝入層析柱用層析系統在280nm 或215nm波長檢測膚類洗脫過程，洗脫中逐步提高乙醇質量百分濃度至75 %，最后用50mM 化OH洗脫，收集40 %~75 %乙醇洗脫組分。
[0019] 在步驟2)中，所述乙臘-水濃度梯度反相HPLC制備可采用C18反相柱Welch 叫timataXB-C18,內徑30mm，高度250mm，填料粒徑10ym，孔徑辨:〇A，所用的流動相按質 量百分比含0. 1 % =氣乙酸；上樣樣品用起始乙臘濃度的含0. 1 % =氣乙酸的水溶液溶解。W20] 在步驟如中，所述乙臘-水等度反相HPLC分離可采用反相柱YMC-Pack 0DS-A250X10mm，填料粒徑5ym;每次上樣40ul，流速1.0血/min;16%乙臘等度洗脫；檢 測波長 280nm、210nm、254nm、230nm。
[0021] 所述環（脯-酪）二膚對乳腺癌、宮頸癌和結腸癌有抑制作用，同時還有免疫活 性、調節激素及調控能量代謝的作用；所述環（脯-鄉）二膚抗媛弧菌作用（MIC為0.05); 體外抗腫瘤活性（13. 3± 1. 6) %巧ug/ml);質量濃度為50yg/ml時對前列腺癌細胞的生長 抑制率約為53% ;對肝癌細胞的抑制率約為17%。
[0022] 本發明W鏈霉菌（Str巧tomycessp. )HNS054為菌種，經過斜面培養、平板培養、液 體發酵培養、分離和提純，最后獲得本發明的兩種環二膚。
[0023] 本發明提供一種大孔樹脂NKA-9吸附和解吸附與高效液相色譜法相結合的分離 環二膚的方法。本發明步驟簡潔，操作簡單，整個分離流程僅需9化便可獲得純環二膚；本 發明所用NKA-9大孔樹脂相較于傳統分離方法所用的凝膠、C18或C8等材料價格低廉。本 發明提供的分離環二膚方法能高效低能的分離出純環二膚，對環二膚類物質的研究具有重 要意義。
[0024] 本發明所用菌株產次級代謝物周期短，所產代謝物活力高，是一株生產性能優良 的菌種。本發明設及到的海洋鏈霉菌環二膚制備方法高效而廉價、處理通量高，易于放大。
【附圖說明】
[0025]圖1為實施例2大孔吸附樹脂NKA-9的洗脫曲線。
[00%] 圖2為實施例2第二級分離洗脫曲線。
[0027] 圖3為實施例3中化合物C-1-0的iH-NMR數據圖。 陽02引 圖4為實施例3中化合物C-1-0的"C-NMR數據圖。
[0029] 圖5為實施例3中化合物C-1-0的質譜信息。
[0030] 圖6為實施例3中化合物C-1-0化學結構。
[0031] 圖7為實施例3中化合物C-1-1的iH-NMR數據圖。
[0032] 圖8為實施例3中化合物C-1-1的"C-NMR數據圖。 陽03引圖9為實施例3中化合物C-1-1的質譜信息。
[0034]圖10為實施例3中化合物C-1-1的化學結構。
【具體實施方式】 陽0對實施例1
[0036] 1、菌種：海洋鏈霉菌（Str巧tomycessp. )HNS054,保藏號為CGMCCNo. 8946。
[0037] 2、發酵及發酵條件：
[003引 （1)、平板培養基：酵母膏：4g，麥芽浸膏：10g，葡萄糖：4g，瓊脂：20g，無菌海水： 1L，抑：7. 3,高壓蒸汽滅菌：110°C，30min。
[0039] 平板培養條件：28°C培養5~7d。
[0040] (2)種子培養基：蛋白腺：5g，酵母膏：lg，憐酸高鐵：0.01g，瓊脂：15~20g，無菌 海水：1000ml，抑：7. 4 ~7. 5。
[0041] 培養條件：轉速為：165rmp，28°C震蕩培養3d，作為液體種子。
[0042] (3)發酵培養基：蛋白腺：5g，酵母膏：lg，憐酸高鐵：0.Olg，瓊脂：15~20g，無菌 海水：1000ml，抑：7. 4 ~7. 5。 陽0創培養條件：轉速為165rmp，28°C震蕩發酵4d。 W44] 實施例2 W45] 1、斜面培養同實施例1 ;
[0046] 2、種子培養同實施例1;
[0047] 3、發酵培養同實施例1 ;
[0048] 4、海洋鏈霉菌環二膚的分離純化： W例 （1)、HNS054在化錐形瓶中發酵化X5瓶，連續流離心錯流過濾，5K濾膜切向流 過濾得發酵液上清。
[0050] 似、在4°C層析柜中，約13LMWC05K膜包濾過液與500血NKA-9大孔吸附樹脂磁 力攬拌過夜（1化)，吸附后的大孔樹脂用500mL去離子水漂洗10次； 陽05U (3)、將樹脂裝入5. 5cmX50cm層析柱，純水3血/min繼續漂洗300ml，然后依次W 10%、25%、40%乙醇311117111111各 3001111，50%、60%乙醇311117111111各1001111，75%乙醇洗脫 300ml，50mMNaOH3mL/min洗脫30