一種蘇云金芽孢桿菌工程菌g033a的分批補料發酵培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物發酵技術領域，具體設及一種蘇云金芽抱桿菌工程菌G033A的 發酵培養基及發酵培養方法。
【背景技術】
[0002] 黃曲條跳甲（Phyllotretastriolata)屬銷翅目、葉甲科，是農業生產的一種害 蟲。目前，防治黃曲條跳甲多使用化學農藥，但化學農藥容易產生抗性W及殘留等問題，如 果有防治效果好的生物農藥，無疑會成為有機綠色食品生產的首選。
[0003] 蘇云金芽胞桿菌度acillusthuringiensis,簡稱Bt)是目前研究最多，應用最為 廣泛的微生物殺蟲劑農藥。由于野生蘇云金芽胞桿菌存在殺蟲譜窄，持效期短，會導致昆蟲 產生抗性等問題，從20世紀80年代中后期W來，隨著對蘇云金桿菌分子生物學和分子遺傳 學的深入研究，不同殺蟲活性的殺蟲晶體蛋白（ICPs)基因的不斷被分離克隆，將不同殺蟲 活性的ICP基因進行體外重組，構建具有優良性能的重組菌株成為國內外研究熱點。
[0004] 蘇云金芽抱桿菌工程菌G033A是由中國農業科學院植物保護研究所通過電擊轉 化的方法將攜帶對銷翅目害蟲高毒力的cry3Aa7基因的重組質粒PSTK-3A導入蘇云金桿菌 野生菌G03 (該菌株含有crylAa、cirlAc、crylC和cry2Ab基因，對鱗翅目重要害蟲具有高 毒力）中，從而構建的對銷翅目和鱗翅目害蟲具有高毒力的雙價基因工程菌，該菌已在申 請號為200310100197. 8的專利申請文件中公開，公開號為1528891，發明名稱為"蘇云金芽 抱桿菌工程菌G033A及其制備方法"。 陽0化]眾所周知，微生物農藥發酵水平的高低直接影響著其效價。蘇云金芽胞桿菌也不 例外，而具有雙價基因的蘇云金桿菌工程菌的發酵要兼顧雙價基因的高效表達，其發酵要 求更高，目前，蘇云金芽胞桿菌發酵方式有固體發酵和液體發酵。生產規模較大的蘇云金桿 菌多采用分批式液體深層通風培養，由于分批式培養是一次性投料和放罐，培養液初始濃 度較高，容易產生底物和代謝產物的抑制作用，亦不利于氧的傳遞，在進入對數生長期后 容易出現供氧不足的現象，發酵過程中蘇云金芽胞桿菌的快速繁殖受到很大影響，難W實 現高密度。補料分批發酵培養技術可W避免在分批發酵中因一次性投入過多造成細胞大量 生長，耗氧過多，W及通風攬拌設備不能匹配的狀況，已開始在蘇云金芽胞桿菌發酵中得到 應用。近年來，盡管隨著理論研究和工業應用的不斷發展，從補料方式到計算機優化控制都 取得較大進展，但蘇云金芽胞桿菌高密度培養技術仍處在探索階段，如何在提高生物量的 同時有效地提高晶體蛋白的表達量是目前急需解決的技術難題。工程菌所處的環境條件對 其質粒的穩定性和表達效率影響機制錯綜復雜，而眾多的環境因素中，培養基組成，培養溫 度，菌體的比生長速率=方面尤為重要，對一個已經組建完成的克隆菌來說，選擇最合適的 發酵工藝是進行工業化生產的關鍵步驟。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種蘇云金芽抱桿菌工程菌G033A的分批補料發酵培養基， 另外還提供一種蘇云金芽抱桿菌工程菌G033A的分批補料發酵培養方法，W充分滿足工程 菌的基本代謝又能實現工程菌雙價基因的高效表達，進而實現該菌的高效工業化生產。
[0007] 上述目的是通過W下技術方案實現的：
[0008] 一種蘇云金芽抱桿菌工程菌G033A的分批補料發酵培養基，它由W下重量配比的 成分組成：葡萄糖0. 8~2%、花生巧4~5%、酵母抽提物0. 2~0. 5%、玉米漿粉0. 2~ 0.4%，水為余量。
[0009] 一種蘇云金芽抱桿菌工程菌G033A的分批補料發酵培養方法，包括W下步驟：
[0010] 1)接種：將處于對數生長期的蘇云金芽抱桿菌工程菌G033A的菌液接種到權利要 求1)所述的分批補料發酵培養基中，所述菌液的ODe。。為3. 2~3. 5,所述菌液的體積占分 批補料發酵培養基體積的10~20%; W11]。發酵：在發酵罐內進行發酵，發酵過程中不間斷地向罐內通入空氣，并控制每 分鐘通入的空氣體積與發酵液的體積比為0.8~1.2 : 1，罐內溫度為27~32°C，罐內壓 力為0. 05~0. 07Mpa，攬拌速度為800~1000巧m，發酵液中的溶氧重量濃度為15~25 %， 并用氨水控制發酵液的抑為6. 8~7. 2;
[0012] 3)補料：從發酵0. 5~化開始補加還原糖和氨基酸，控制補料速率，保持發酵液 中還原糖的重量濃度為0. 5~1%，補加的氨基酸的總重量占發酵液重量的0. 5~2%，5~ 1化后結束補料； 陽01引 4)發酵終止：32~4化后，終止發酵。
[0014] 優選地，所述方法包括W下步驟：
[0015] 1)接種：將處于對數生長期的蘇云金芽抱桿菌工程菌G033A的菌液接種到權利要 求1)所述的分批補料發酵培養基中，所述菌液的ODe。。為3. 4,所述菌液的體積占分批補料 發酵培養基體積的15%;
[0016]。發酵：在發酵罐內進行發酵，發酵過程中不間斷地向罐內通入空氣，并控制每 分鐘通入的空氣體積與發酵液的體積比為1 : 1，罐內溫度為30°C，罐內壓力為0.065Mpa， 攬拌速度為90化pm，發酵液中的溶氧重量濃度為17%，并用氨水控制發酵液的抑為7;
[0017] 3)補料：從發酵化開始補加還原糖和氨基酸，控制補料速率，保持發酵液中還原 糖的重量濃度為0. 8%，補加的氨基酸的總重量占發酵液重量的1. 5%，化后結束補料；
[00化]4)發酵終止：3化后，終止發酵。
[0019] 進一步優選地，所述還原糖為葡萄糖，所述氨基酸為復合氨基酸，所述復合氨基酸 由W下成分組成：天口冬氨酸8~10%;蘇氨酸3~6%;絲氨酸10~15%;谷氨酸10~ 15%;甘氨酸10~15%巧氨酸3~6%;鄉氨酸6~10%;甲硫氨酸0.5~1%;異亮氨 酸1~5%;亮氨酸1~5%;酪氨酸0. 5~2%;苯丙氨酸1~5%;賴氨酸1~5%;組氨 酸0.5~2%;精氨酸6~10%;脯氨酸10~15%。
[0020] 本發明有W下優點：
[0021] (1)采用本發明的發酵培養基和發酵工藝，能使發酵液菌數達到62億/ml,發酵液 中工程菌G033A的內源基因和外源基因所表達的兩種蛋白晶體130kD/65kD含量分別提高 到0. 58% /0. 82%，而且其發酵液對棉鈴蟲效價可達到7012IU/y1。各項結果均處于較高 水準，是一個較理想的工業化發酵工藝。 陽〇巧 似本發明具有發酵周期短，生產成本低等優點。
【具體實施方式】 陽〇2引 實施例1
[0024] 通過響應面分析法，采用部分主要因子篩選設計、最睹坡試驗和中屯、組合設計 (CentralCompositeDesign)，從而獲得蘇云金芽抱桿菌工程菌G033A最佳的分批補料發 酵培養基，它由W下重量配比的成分組成：葡萄糖1. 5%、花生巧4. 5%、酵母抽提物0. 4%、 玉米漿粉0.3%，水為余量。
[00巧]使用獲得的培養基進行蘇云金桿菌工程菌G033A的發酵代謝研究，研究了工程菌G033A外源cry3類基因表達的65kD晶體蛋白與內源cryl、cry2類基因表達的130kD晶體 蛋白的形成時間與表達量差異及其生長代謝規律，結合蘇云金桿菌工程菌G033A外源基因 與內源基因表達的時空差異，進一步對培養過程中各參數的變化及對發酵代謝影響因素進 行研究與分析，確定了W葡萄糖為補料碳源和復合氨基酸為補料氮源的補料發酵工藝。 [00%] 最終確定的分批補料發酵培養方法包括W下步驟：
[0027] 1)接種：將處于對數生長期的蘇云金芽抱桿菌工程菌G033A的菌液接種到W上所 述的分批補料發酵培養基中，所述菌液的ODe。。為3. 4,所述菌