一株高效共發酵葡萄糖和木糖的重組釀酒酵母菌株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一株釀酒酵母及其應用，尤其設及一株高效共發酵葡萄糖和木糖的重 組釀酒酵母菌株及其應用，屬于微生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 當前，開發利用可再生能源已成為世界各國保障能源安全、加強環境保護、應對氣 候變化的重要措施。生物燃料乙醇，由于其獨特的車用屬性，是公認的很有發展前景的可再 生生物能源之一。由于W玉米、小麥、木馨、紅馨等糧食及非糧淀粉為原料的第1代、1. 5代 燃料乙醇的生產不可避免地存在"與人爭糧"、"與糧爭地"的問題，均不能得到大規模發展， 因此W儲量豐富且廉價的可再生木質纖維素生物質為原料進行第二代燃料乙醇的生產被 認為是燃料乙醇可持續發展的必然選擇。
[0003]釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)是傳統的乙醇生產菌株，也是二代燃料 乙醇生產的首選發酵微生物。然而，其真正用于二代燃料乙醇的生產需要解決兩方面的難 題：首先是木糖代謝問題，木糖是木質纖維素原料中含量僅次于葡萄糖的單糖，對其有效的 代謝和發酵可W顯著降低二代燃料乙醇的生產成本從而提高其經濟競爭力，然而，由于缺 乏木糖代謝相關基因，天然釀酒酵母并不能很好的代謝木糖；其二是抑制物問題，木質纖維 素原料在預處理及酶解過程中，會產生大量對微生物生長及發酵有抑制作用的化合物，故 增加釀酒酵母自身對運些抑制物的耐受性可W提高發酵過程中乙醇的生成速率。因此，開 發一株能高效共發酵葡萄糖和木糖同時也具有較高抑制物耐受性的釀酒酵母是目前重點 研究的課題，高效共發酵葡萄糖和木糖的釀酒酵母菌株也是第二代燃料乙醇經濟有效生產 的必要條件。
【發明內容】
[0004]針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一株高效共發酵葡萄糖和木糖 的重組釀酒酵母菌株及其應用。
[0005]本發明所述的高效共發酵葡萄糖和木糖的重組釀酒酵母菌株，其特征在于：該菌 株名為釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)LF1，已于2015年09月08日保藏在"中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號 院3號）"，保藏編號為CGMCCNo. 11331。
[0006] 上述高效共發酵葡萄糖和木糖的重組釀酒酵母菌株構建的主要技術思路是：將 含有異源木糖異構酶基因Ru-xylA表達框的DNA片段整合到釀酒酵母菌株BSIF染色體的 閒013基因座位；進而將含有非氧化憐酸戊糖途徑四個基因串聯表達框的兩個相應DNA片 段整合到上述操作獲得的菌株染色體的GRE3基因座位的一部分；進而將含有異源木糖異 構酶基因Ru-xylA表達框的DNA片段整合到上述操作獲得的菌株染色體上的逆轉錄轉座子 Tyl上的5-sequence區域；進而用含有TEF1啟動子的DNA序列轉化上述操作獲得的菌株， 將該菌株染色體中XKSl基因的啟動子替換為TEFl啟動子；進而將上述操作獲得的菌株在 木糖為唯一碳源培養基中進行長期馴化培養；進而將上述操作獲得的菌株在預處理玉米賴 桿漸出液中進行長期馴化培養；進而用含有木糖專一性轉運蛋白基因Mgt05196(N360巧表 達框的DNA片段整合到上述操作獲得的菌株GRE3基因座位剩余的另一部分；進而將上述操 作獲得的菌株在木糖為唯一碳源培養基中進行馴化培養。
[0007] 具體的，上述高效共發酵葡萄糖和木糖的重組釀酒酵母菌株的構建方法，步驟 是：
[0008] 構建質粒PXIP1和PXIP2,用限制性內切酶EcoRI和SphI酶切上述質粒，得到含有 異源木糖異構酶狂I,xyloseisomerase)基因Ru-xylA(專利公開號為US20120225452A1) 表達框的兩個相應整合片段，將兩個整合片段依次轉化野生型二倍體釀酒酵母菌株BSIF， 得到重組菌株并命名為B-XI-6,其基因型為地〇13::XI;用限制性內切酶Smil分別消化 處理質粒PJPPP3和PJPPP4,得到含有非氧化憐酸戊糖途徑四個基因（RPE1，服II，TALIW 及TKL1)串聯表達框的兩個相應整合片段，將兩個整合片段依次轉化菌株B-XI-6,得到重 組菌株并命名為B-XI-6P，其基因型為地〇13: :XI，gre3::PPP;通過融合PCR構建整合片段 RAl-KanMX-TEFlp-RA3 和RA2-KanMX-TEFlp-RA3,將兩個整合片段依次轉化菌株B-XI-6P， 得到重組菌株并命名為BSN0 (其兩條同源染色體上木酬糖激酶基因XKS1的啟動子替換為 組成型強啟動子TEFlpromoter)，其基因型為地〇13: :XI，gre3: :PPP，XK;構建質粒pXI5， 用限制性內切酶EcoRI和SphI酶切質粒得到含有兩個串聯異源木糖異構酶基因Ru-xylA 表達框的整合片段，W菌株BSN0為基礎，將此片段進行=輪整合，得到菌株并命名為BSN3， 其基因型為地〇13::XI，3S::XI，gre3::PPP，XK;W菌株BSN3為基礎，對其在木糖為唯 一碳源培養基中進行長期馴化培養，篩選得到菌株并命名為XH7,其基因型為地〇13: :XI， 3 5 : :XI，gre3: :PPP，XK，AE 菌株XH7為基礎，對其在預處理玉米賴桿漸出液中進行長期 馴化培養，篩選得到菌株并命名為XHR11，其基因型為地〇13: :XI，3 5 : :XI，gre3: :PPP，XK，AE-PCS;構建重組質粒PUC-N360F，用限制性內切酶Swal線性化所述質粒，所得整合片段轉 化菌株XHR11，得到整合異源糖轉運蛋白基因N360F(專利申請公開號CN104263739A)的重 組釀酒酵母菌株并命名為釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)XHRll-N360F，其基因型 為地〇13: :XI，3 5 : :XI，gre3: :PPP，XK，AE-PCS，N360F菌株XHR11-N360F為基礎，對其在 木糖為唯一碳源培養基中進行馴化培養，篩選得到菌株并命名為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)LFl，其基因型為地〇13: :XI，3 5 : :XI，gre3: :PPP，XK，AE-PCS，N360F，AE。
[0009] 本發明所述的高效共發酵葡萄糖和木糖的重組釀酒酵母菌株在W葡萄糖和木糖 為碳源的混合糖培養基中發酵生產乙醇的應用。
[0010] 本發明所述的高效共發酵葡萄糖和木糖的重組釀酒酵母菌株在木質纖維素水解 液中發酵生產乙醇的應用。
[0011] 上述高效共發酵葡萄糖和木糖的重組釀酒酵母菌株在W混合糖（80gLi葡萄糖、 40gLi木糖）為碳源、YEP(20gL1蛋白腺，lOgL1酵母提取物）為氮源、初始接種量為 0.5g化ycellwei曲tLi及搖瓶限氧條件下發酵，16小時即可耗盡培養基中全部葡萄糖 及絕大部分木糖巧5. 35% )，發酵液中乙醇濃度達到58. 74gL1，同時乙醇得率達到0. 472g giconsumedsugars,為最大理論乙醇得率的93%;在W木質纖維素為原料，5gLi尿素為 氮源、初始接種量為〇.5g化ycellwei曲tLi及搖瓶限氧條件下發酵生產乙醇時，本發明 所述的高效共發酵葡萄糖和木糖的重組釀酒酵母菌株LFl同樣具有較好表現，其中在泉林 水解液原料中，菌株LF1發酵20小時消耗約86. 8%木糖，糖醇轉化率為0. 480,達到理論值 的 94. 1 %。
[0012] 本發明所述的高效共發酵葡萄糖和木糖的重組釀酒酵母菌株LF1無論在沒有抑 制物的混合糖培養基或是含有多種抑制物的多種木質纖維素水解液中，都具有提高的木糖 發酵能力。菌株LF1比文獻報道的工程菌株具有更優的發酵能力，在相同發酵條件下，已報 道的Diao等的研究中，最優菌株CIBTS0735需要20小時才能代謝培養基中所有的80gL1 葡萄糖和40gLi木糖，乙醇得率為0.454ggiconsumedsugars,且其對葡萄糖和木糖的 利用具有明顯的時間先后順序值iaoetal.，2013)。而本發明所述的重組釀酒酵母菌株 LF1具有較強的葡萄糖木糖共發酵能力，在發酵12小時，葡萄糖完全耗盡，同時有約77. 6% (33. 24gLi)的木糖同時被利用。預示本發明公開的重組釀酒酵母菌株LF1已基本具備利 用木質纖維素原料發酵生產燃料乙醇的實際產業化潛力。
【附圖說明】
[0013] 圖1質粒YEp-CH的構建示意圖及特征圖。
[0014]其中：GALlp，GAL1 啟動子；CYClt，CYC1 終止子；TEFlp，TEF1 啟動子；TEFlt，TEF1 終止子。
[0015] 圖2同源臂片段P冊13-B1、B2、B3在酵母兩條染色體上的相對位置。
[0016] 圖3質粒PJFE3-XIH的構建流程圖。
[0017] 圖4質粒pUC-KanMXH-XI-3的構建流程圖。
[001引圖5質粒PXIP1和PXIP2的構建流程圖。
[0019] 圖6質粒PJPPP3和PJPPP4特征圖。
[0020] 其中：TPIlp，TPI1 啟動子；PGKlp，PGK1 啟動子；FBAlp，FBA1 啟動子；ADHlp，ADH1 啟動子。
[0021] 圖7同源臂片段GRE3-RA1、RA2及RA3在酵母兩條染色體上的相對位置。
[002引 圖8同源臂片段XKS1-RA1、RA2和RA3在酵母兩條染色體上的相對位置。
[0023]圖 9 整合片段RAl-KanMX-TEFlp-RA3 和RA2-KanMX-TEFlp-RA3 的構建過程。
[0024] 圖10質粒pXIS的構建示意圖。
[00巧]圖11菌株BSN3在YEPX培養基中馴化過程中細胞量倍增時間燈）變化。
[0026] 圖12菌株XH7在預處理玉米賴桿漸出液培養基中馴化過程中細胞量倍增時間燈） 變化。
[0027] 圖13菌株XH7及其馴化培養物在預處理玉米賴桿漸出液固體平板上生長情況對 比。
[0028] 其中：(A)菌株XH7在預處理玉米賴桿漸出液固體平板上的生長情況；度）馴化培 養物在預處理玉米賴桿漸出液固體平板上生長情況。
[0029] 圖14同源臂片段GRE3-RA4及RA3'在酵母兩條染色體上的相對位置。
[0030] 圖15GRE3