大腸桿菌的快速檢驗試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細菌檢測技術領域，具體涉及大腸桿菌的檢測裝置與方法。
【背景技術】
[0002]大腸桿菌是人和許多動物腸道中最主要且數量最多的一種細菌，周身鞭毛，能運動，無芽孢。主要生活在大腸內。大腸桿菌是引發腸道疾病以及系統性疾病的主要病原菌。研究表明，飲用水、食品中大腸桿菌的數量，可作為其安全程度的重要指標。因此，大腸桿菌的檢測具有重要研究意義。
[0003]傳統大腸桿菌檢測主要有兩種方法，一種需要進過提取分離培養，細菌形態鑒定等步驟較為繁瑣。然而，這種技術具有局限性，多種細菌并不具可供鑒定的形態學特征；細菌培養技術本身會引入很大的誤差，重復性低。這種傳統大腸桿菌檢測試劑的種類繁多耗時較長，而且試劑大多放在各個試劑瓶內，取用較為麻煩而且還容易搞錯試劑，不利于長期發展。另外一種，實時熒光定量PCR，可將細菌樣品的特異性DNA進行擴增，同時進行熒光定量檢測。但這種方法極易產生非特異性產物，從而形成假陽性結果。
[0004]本方案提出的大腸桿菌的16S rDNA基因鑒定手段可克服以上問題。該手段不需細菌培養，直接提取樣品基因組，繼而進行特異性基因擴增檢測。所需時間只需數小時。本發明所用的16S rDNA基因片段異性強，能有效地作為目標大腸桿菌的鑒定標記，提高檢測結果的準確性。本發明所用的PCR技術和電泳技術靈敏度高，電泳技術對PCR產物進行分離/純化檢測，從很大程度上排除假陽性的可能性。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于，提供一種大腸桿菌的快速檢驗試劑盒，解決以上技術問題。
[0006]本發明的另一目的在于，提供一種大腸桿菌的快速檢測方法，解決以上技術問題。
[0007]本發明所解決的技術問題可以采用以下技術方案來實現:
[0008]—種大腸桿菌快速檢驗的試劑盒，包括試劑盒主體，其特征在于，所述試劑盒主體還設有至少三個相對獨立的密封腔室，分別為裝有預處理液的第一腔室，裝有PCR反應液的第二腔室和裝有電泳液的第三腔室；
[0009]所述預處理液是一用于溶解并分散大腸桿菌的處理液；所述PCR反應液是一用于對大腸桿菌的16S rDNA片段進行特異性的復制增殖的PCR反應液；所述電泳液是一用于將采用所述PCR反應液得到的DNA分子進行電泳檢測的電泳液。
[0010]本發明通過預處理液能夠免去提取分離培養等步驟，可以直接得到大腸桿菌基因組，節省了時間提高了效率。所述預處理液能破壞采集到的細菌的細胞壁和細胞膜，獲得細菌細胞的內容物將細菌的DNA釋放到溶液中的預處理液。PCR反應液提供反應引物，反應原材料，合成所需要的酶。
[0011]所述第一腔室設有第一管路，所述第二腔室設有第二管路，所述第一管路和第二管路設有至少一個第一交叉點，所述第一交叉點為所述預處理液和所述PCR反應液進行反應的第一反應點；所述第三腔室設有第三管路，所述第三管路與所述第二管路設有至少一個第二交叉點，所述第二交叉點為所述PCR反應液和所述電泳液進行反應的的第二反應點。確保第一腔室，第二腔室導通、第二腔室與第三腔室導通。
[0012]所述第一腔室設有第一管路，所述第二腔室設有第二管路，所述第一管路和第二管路設有至少一個第一交叉點，所述第一交叉點為所述預處理液和所述PCR反應液進行反應的第一反應點；所述第三腔室設有第三管路，所述第一反應點與所述第三管路設有至少一個第二交叉點。確保第一腔室，第二腔室導通，所述預處理液和所述PCR反應液在第一交叉點進行反應，第二交叉點與第三腔室導通，從而實現所述預處理液和所述PCR反應液反應后的反應液與電泳液在第二交叉點反應。
[0013]所述第一管路與所述第三管路設有至少一個第三交叉點。
[0014]確保第一腔室，第二腔室和第三腔室三者之間兩兩相互導通便于檢測。
[0015]所述預處理液是磷酸緩沖鹽溶液。
[0016]所述磷酸緩沖鹽溶液主要成分以質量百分比，包括3 O %?4 5 %磷酸二氫鉀、15%?25%磷酸氫二鈉、25%?35%氯化鈉、10%?13%氯化鉀和10%?15%水。磷酸緩沖鹽溶液具有鹽平衡、可調整的適宜PH緩沖作用。
[0017]所述PCR反應液主要成分以容積計，包括3 μ L-1O μ L三羥甲基氨基甲烷緩沖液，2 μ L-8 μ L脫氧核糖核苷三磷酸，0.2 μ L_0.5 μ L DNA聚合酶和I μ L-2 μ L大腸桿菌細菌的特異性引物和35 μ L-40 μ L去離子水。三羥甲基氨基甲烷緩沖液用作核酸和蛋白質的溶劑，也是蛋白質電泳緩沖液的主要成分之一。
[0018]所述大腸桿菌細菌的特異性引物的濃度在150nmol/L?250nmol/L之間。
[0019]所述脫氧核糖核苷三磷酸的濃度在2nmol/L?3nmol/L之間。
[0020]最適條件可進行梯度實驗進行調整。
[0021]所述三羥甲基氨基甲烷緩沖液的PH值在7.8?8.4之間，優選為PH = 8。
[0022]弱堿環境下緩沖液發揮的功效最大。
[0023]所述電泳液是羥乙基纖維素溶液。對電介質具有異常好的鹽溶性。
[0024]所述特異性引物序列為:
[0025]上游引物:5’ -GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC-3 ’
[0026]下游引物:3’-AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA-5’。用于對大腸桿菌細菌的 16SrDNA片段進行特異性的復制增殖。
[0027]所述試劑盒主體是由聚乙烯制成的試劑盒主體。聚乙烯質量輕硬度大，成本低，使用壽命長。
[0028]所述試劑盒主體保存的條件在-15攝氏度?-30攝氏度，優選為-20攝氏度。低溫環境能保持試劑活性，減慢試劑降解的速度。
[0029]作為一種方案，所述試劑盒主體的體積不超過200 μ L0降低檢測成本。
[0030]作為另一種方案，所述試劑盒單次使用各試劑的體積均在yL量級。
[0031]—種大腸桿菌的快速檢測方法采用所述大腸桿菌快速檢驗的試劑盒進行檢測。
[0032]—種大腸桿菌的快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0033]步驟一，大腸桿菌待測樣本液氮研磨，取0.05g?0.07g粉末，浸泡在所述預處理液中，使得樣本中的大腸桿菌的內容物釋放在溶液中；
[0034]步驟二，取步驟一所得到I μ L?20 μ L的溶液，添加到所述PCR反應液中，進行PCR反應，使大腸桿菌的16S rDNA片段進行特異性的復制增殖；
[0035]步驟三，取步驟二所得到的IyL?1yL溶液，使用所述電泳液進行毛細管電泳分離和檢測，根據電泳檢測到的DNA情況，得出大腸桿菌的陰、陽性。
[0036]本發明減少了多種試劑的使用，從而對檢測大腸桿菌的效率進行進一步的提升，優化了檢測步驟，減少了錯誤率。步驟三中若電泳檢測到544bp的DNA，即表明樣本中含有大腸桿菌，反之則沒有。特異性強，靈敏度高。通過PCR反應和特異性引物，樣本中對應于大腸桿菌的特異性DNA序列數量得到極大增加，其增殖倍數可達109，樣本中的少量大腸桿菌細菌就可被檢測到。而樣本中其它來源的DNA數量則不會得到增加，不會干擾目標細菌的檢驗。速度快，效率高，每個PCR產物的電泳檢出時間通常不超過8分鐘。
[0037]所述步驟三中，若電泳檢測到來自于大腸桿菌的544bp的特異性序列，即表明樣本中有大腸桿菌，反之則沒有。
[0038]所述步驟一中，浸泡時間不少于2分鐘，優選為3分鐘。使物質充分釋放在溶液中。
[0039]所述步驟二中反應條件包括將大腸桿菌待測樣品放置在常規PCR儀中，先預熱5-10分鐘，所述預熱環境在90攝氏度?100攝氏度，然后在第一溫度階段和第二溫度階段中反復循環10-40次。確保盡可能檢測到真實的數據。
[0040]所述第一溫度階段為持續10秒?15秒在95攝氏度?100攝氏度的環境中；所述第二溫度階段為持續30秒?40秒在55攝氏度?70攝氏度的環境中。對大腸桿菌進行特異性的PCR增殖。
[0041]作為一種優選方案，所述預處理液為100 μ L磷酸緩沖鹽溶液，所述PCR反應液包括三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH = 8)5 μ L ;脫氧核糖核苷三磷酸0.2mM;DNA聚合酶0.25 μ L，大腸桿菌的特異性引物200ηΜ，上/下游引物各I μ L ;去離子水37.75 μ L ;共49 μ L ;大腸桿菌的特異性引物序列為:
[0042]上游引物:5’ -GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC-3 ’
[0043]下游引物:3’ -AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA-5 ’ 電泳液:0.5 % 羥乙基纖維素(1300k)溶液，含 Ix SYBR Green I，共 50 μ L0
[0044]作為一種優選方案，大腸桿菌的檢測方法包括:
[0045]步驟一，大腸桿菌待測樣本液氮研磨，取0.05g?0.07g粉末，浸泡在所述預處理液中3分鐘，使得樣本中的大腸桿菌的內容物釋放在溶液中；
[0046]步驟二，取步驟一所得到I μ L的溶液，添加到所述PCR反應液中，將PCR反應液置于PCR儀內，95°C (預熱)2分鐘，然后設置95°C (變性)10秒、64°C (退火和延伸)30秒兩個溫度階段，循環40次，最后冷卻至4攝氏度；
[0047]步驟三，取步驟二所得到的溶液置于樣品位置，所述電泳液填充入毛細管，電場強度lOOV/cm進樣2秒；然后以電場強度200V/cm電泳，采用熒光檢測；若電泳檢測到來自于大腸桿菌的544bp的特異性序列，即表明樣本中有大腸桿菌，反之則沒有。
【附圖說明】
[0048]圖1為本發明的熒光檢測信號的一種示意圖；
[0049]圖2為本發明大腸桿菌的檢測方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0050]為了使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體圖示，進一步闡述本發明。
[0051]參照圖1、圖2，一種大腸桿菌快速檢驗的試劑盒，包括試劑盒主體，試劑盒主體還設有至少三個相對獨立的密封腔室，分別為裝有預處理液的第一腔室，裝有PCR反應液的第二腔室和裝有電泳液的第三腔室；預處理液是一用于溶解并分散大腸桿菌的處理液；PCR反應液是一用于對大腸桿菌的16SrDNA片段進行特異性的復制增殖的PCR反應液；電泳液是一用于將采用PCR反應液得到的DNA分子進行電泳檢測的電泳液。本發明通過預處理液能夠