一種合成多肽及其應用和抗流感病毒疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及免疫學技術領域，具體的說是設及一種合成多膚及其應用和抗流感病 毒疫苗。
【背景技術】
[0002] 流感病毒大爆發是迄今為止對人類生產生活影響最大的流行性疾病之一。上世紀 爆發的=次大流感流行，都是由流感病毒引起的，造成了數千萬人口死亡，給人類健康和經 濟造成了巨大危害和損失。據WHO統計，全球每年約有10億人感染流感病毒，50-100萬人 死于流感。不同流感病毒亞型的劃分是基于紅細胞凝集素HA和神經氨酸酶的序列，現階段 在人群中傳播的主要流感病毒亞型為甲型H1N1，H3N2W及乙型流感病毒。
[0003] 阻止流感最有效方法就是接種疫苗，現階段針對流感病毒的上市疫苗主要包括全 病毒滅活疫苗、裂解疫苗和亞單位疫苗，每種疫苗均含有甲1亞型、甲3亞型和乙型3種流 感滅活病毒或抗原組份，但是流感病毒傳播廣泛，復雜多變，疫苗需要不斷更新，且WK)的 預測準確性有限。
[0004] 所W高保守性、特異功能性表位疫苗應運而生，而國內已有的相關流感病毒多膚 疫苗產品專利大多針對臟及126區域，如：申請號〔肥00810232851、〔肥00810071174 ^及 CN200810071174。但針對流感病毒表面蛋白HA的表位疫苗研究不足。 陽0化]HA蛋白是流感病毒表面主要的包膜糖蛋白，在感染細胞過程中，其作用主要表現 為結合宿主細胞受體，介導胞吞作用及膜融合過程。HA是流感病毒主要抗原區并且包含大 多數中和抗體結合位點。并且由于宿主免疫壓力的存在，HA是流感病毒免疫逃逸的主要突 變點，其抗原轉變也是造成流感病毒大流行的主要原因。早期對HA抗原區域的研究表明， HA抗原區域包含著大量的中和抗體結合位點，而在運之中，針對流感病毒HA1的中和抗體 直接抑制病毒與宿主細胞受體的結合，從而達到抑制病毒對宿主細胞的感染。但由于宿主 體內的免疫壓力，HA1通過極高的突變率及糖基化位點來進行免疫逃逸。所W針對HA1的 疫苗保護效果不甚良好。
[0006] 最近，更多的研究者將疫苗的研究重點轉移到HA2上。并且已經分離得到了識別HA2頸部區域的多種具有廣譜中和活性的抗體。如單克隆抗體CR6261通過結合HA能夠中 和groupl內的大多數病毒，包括H1、冊、H9、肥，但其對group2無中和作用。單克隆抗體 CR8020能夠中和大部分group2病毒，包括能夠感染人的冊和H7亞型病毒（7-8)。但是， 運些單克隆抗體的獲得是從個別愈后患者（或動物）篩選得到，具有很大的偶然性，不具備 重現性，且造價昂貴。另外一個不足就是，運些單克隆抗體屬于被動免疫，雖然運種免疫力 效應快，但維持時間短。一般用于治療，或在特殊情況下用于緊急預防。相對于由機體自身 產生抗體，使機體不再擔屯、被病毒感染的主動免疫來說，其仍然略顯不足。
[0007] 為了能夠解決主動免疫的問題，有研究人員通過模擬HA2全蛋白S維構象來作為 免疫原進行疫苗的制備，然而運種方法并不能保證其百分百保證所合成多膚與HA2S維構 象一致，致使所制成疫苗不具備免疫原性。同時，工作量大、成本高也是該方法的一大弊端。 也有研究人員考慮采用相對低廉和簡單的全病毒進行疫苗的制備，但是HA2在天然病毒中 不暴露，利用全病毒作為免疫原誘導的抗體無法識別HA2,通過全病毒無法誘導出針對HA2 的中和抗體。此外，全病毒免疫處理方式極其復雜，成本相對合成膚疫苗也是比較高的。因 此，如何能夠針對流感病毒HA2研制出一種廣譜、簡單有效的合成多膚疫苗是當務之急。
【發明內容】
[0008] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種合成多膚及其應用和抗流感病毒疫苗，使 所述合成多膚針對流感病毒HA2抗原區，且簡單有效，具有高效價、廣譜性和保守性，能夠 應用于流感疫苗的制備中，特別是針對H3亞型流感病毒。
[0009] 為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
[0010] 一種合成多膚，氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示（W下簡稱P6)。
[0011] 本發明針對HA2抗原區中的頸部區設計一種新型的具有免疫原性合成多膚，該多 膚只包含15個氨基酸，設計簡單成本低廉。經過檢測，本發明合成多膚同時具有化2細胞 表位和B細胞表位，表明本發明合成多膚能夠促進體液免疫，所誘導抗體具有較高效價。此 夕F，將本發明所述合成多膚與1968-2014年10763株冊亞型菌株HA2氨基酸序列比對分析， 本發明所述合成多膚氨基酸序列與對比菌株相比具有高達97%W上的保守性。
[0012] 為了驗證本發明合成多膚與HA蛋白的結合活性W及血凝抑制活性，本發明選取 同樣針對HA2抗原區中的頸部區且經過比對保守型在97%W上的其他5個合成多膚（W下 簡稱P1-P5)進行對比檢測，其氨基酸序列如SEQIDN0:2-6所示；其中，分別為P1針對HA2 中76-90位氨基酸序列、P2針對HA2中86-100位氨基酸序列、P3針對HA2中96-110位氨 基酸序列、P4針對HA2中106-120位氨基酸序列、P5針對HA2中116-130位氨基酸序列。
[0013] 將6個合成多膚WKLH載體疫苗、多分支膚疫苗或諾如病毒P顆粒載體疫苗的形 式制成具體疫苗進行相關檢測。在抗體分型試驗中，通過酶聯免疫吸附試驗巧lisa),檢 測各合成多膚免后血清對A/化isbane/10/2007 (H3)HA蛋白的結合活性，結果顯示，同時包 含B/Th2細胞表位的本發明合成多膚免疫原免后血清結合活性最高，說明本發明合成多膚 具有高效價，而其余合成多膚極其顯著的低于本發明結合活性；同時檢測上述合成多膚免 后血清對A/California/04/2009〇nNl)HA蛋白、A/Canada/720/2005〇12N2)HA蛋白、A/ Anhui/1/2005 〇15Nl)HA蛋白、A/Netherlands/219/03 (H7N7)HA蛋白的交叉結合活性，結果 顯示，本發明合成多膚對1、2、5、7各亞型病毒HA蛋白交叉結合活性最高，也表明了本發明 合成多膚具有廣譜性；此外，通過抗體分型試驗，檢測出本發明合成多膚免后血清中抗體成 分主要為IgG，表明所設計免疫原成功的促進了體液免疫，運是能夠作為主動免疫疫苗的基 礎。
[0014] 并且，通過微中和與RT-qPCR聯用試驗，本發明合成多膚免疫后血清對A/17/ Perth/09/87化3)病毒，A/Wisconsin/67/2005化3)病毒、A/17/Texsa/2012/30(H3)病毒都 具有一定中和活性，再次表明了本發明合成多膚具有高度保守性。
[0015] 在與全病毒免疫的對比試驗中，本發明從正反兩個方面驗證了W全病毒免疫無法 獲得針對HA2的抗體，而通過本發明所述合成多膚能夠誘導產生針對HA2的抗體。
[0016] 基于上述多種有益效果，本發明提供SEQIDNO: 1所示氨基酸序列的合成多膚在 制備抗流感病毒疫苗中的應用。
[0017] 作為優選，所述流感病毒為HI、肥、冊、冊或H7亞型流感病毒。
[0018] 本發明還提供一種抗流感病毒多膚疫苗，其包含SEQIDN0:1所示氨基酸序列的 合成多膚。
[0019] 作為優選，所述多膚疫苗為KLH載體疫苗、多分支膚疫苗或諾如病毒P顆粒載體疫 苗。更優選地，所述多分支膚為四分支膚或八分支膚。
[0020] 上述KLH載體疫苗、多分支膚疫苗或諾如病毒P顆粒載體疫苗為本領域常規的疫 苗制劑形式，在獲知本發明所述合成多膚后，均可W按照本領域常規方法或經由試劑公司 制備獲得。 陽02U 例如，所述KLH載體疫苗的制備方法可參照如下：
[0022] 合成多膚在C-端合成一個切S，將20mgSMCC(運是聯接40條多膚的量）溶于 2mlDMF。將0.8mlKLH加入到25ml圓底燒瓶中，補加lXPBS(pH7. 2)使蛋白終濃度為 15mg/ml。將溶解好的SMCC溶液緩慢滴加到120mgKLH蛋白體系中，室溫攬拌反應比。用 1L1XPBS腫7. 4)溶液于4°C下透析6小時，除去游離的SMCC。將透析后的KLH蛋白倒 入50ml離屯、管中，通過離屯、管的刻度確定其體積，根據反應前加入的KLH蛋白的量來計算 透析后蛋白的濃度，然后根據其濃度將2. 5mgKLH-SMCC溶液轉移到5ml離屯、管中。 陽02引舉例說明：反應前加入KLH蛋白的量為120mg，透析后的KLH蛋白體積為20ml，那 么透析后的KLH蛋白濃度為6mg/ml，應取出2. 5/6 = 417y1KLH-SMCC溶液轉移到5ml離 屯、管中。將3.Omg多膚用0.6ml1XPBS(抑7. 2)溶液溶解（運里多稱量出0. 5mg多膚是 用來做化ISA檢測的，取出100 即可）。
[0024] 檢測多膚隨交聯好的抗原一起寄出，濃度為5mg/ml。用Ellman試劑檢測多膚中的 琉基：在96孔板中加入100y1Ellman試劑儲備液，再加入10y1多膚溶液，用Nano分光 光度計在^ = 412皿下測其紫外吸收值，如果0D值〉0. 15做下一步；0D值<0. 15并〉0. 05 補加多膚，直至達到要求；0D值<0. 05返回多膚合成步驟重新質控。Ellman試劑是用來檢 測游離琉基的，如果檢測液顯黃色說明多膚的切S的琉基大部分W游離態存在；如果檢測 液不顯黃色則說明多膚切S中的琉基已經被氧化形成二聚體或多聚體。將多膚液滴加到 KLH-SMCC管中，室溫下用垂直混勻器混勻反應4小時。用Ellman試劑檢測多膚中的琉基： 在96孔板中加入100y1Ellman試劑儲備液，再加入10y1教練后的多膚溶液，用Nano分 光光度計在^ = 412nm下測定紫外吸收值。0D值<0. 03說明多膚和KLH蛋白交聯率已達 到80%W上；孤值〉〇. 03則再補加SMCC活化好的KLH蛋白繼續交聯。如果Ellman試劑顯 黃色說明多膚與KLH蛋白偶聯不完全；如果Ellman試劑不顯黃色則說明多膚已經全部與 KLH蛋白偶聯。
[0025] 所述多分支膚疫苗的制備方法可參照碩±論文《分支膚的合成與蛋白忍片的制 作》中2. 4部分內容。而所述諾如病毒P顆粒載體疫苗，可將諾如病毒P顆粒與編碼本發明 合成多膚的基因共同插入原核表達載體PET-28a中，標簽為6個化S，轉化入表達載體化21 感受態內，經過夜誘導，包涵體溶解，蛋白親和純化，蛋白復性，即可獲得。
[00%] 由W上技術方案可知，本發明針對HA2抗原區中的頸部區設計一種新型僅包含15 個氨基酸的具有免疫原性的合成多膚，其同時具有T/B細胞表位，能夠誘導體液免疫，結合 包括化、肥、冊、冊、H7在內的多種亞型流感病毒，同時對冊亞型各種毒株均具有中和活性， 相比同樣針對該抗原區的其他合成多膚，本發明合成多膚活性最高，具有高效價、高保守性 和廣譜性，具有作為各亞型流感病毒疫苗的巨大優勢。
【附圖說明】
[0027]圖 1 所示為P1/P2/P3/P4/P5/P6-KLH免后血清對A/化isbane/10/2007 (冊)HA蛋 白的結合活性的效價柱形圖，縱坐標表示抗體效價；
[0028] 圖2所示為P6-KLH免后血清中抗體分型實驗紫外吸收光譜柱形圖，橫坐標中 Pre-sera表示免疫前血清，為對照，Anti-sera表示免疫后血清；
[0029] 圖3所示為P1/P2/P3/P4/P5/P6-KLH免后血清對不同亞型流感病毒株HA蛋白的 結合活性紫外吸收光譜柱形圖；
[0030] 圖4所示為病毒W及本發明合成多膚免疫原免后血清對HA2多膚和全病毒結合活 性的紫外吸收光譜折線圖；其中