使用粘土礦物和堿性溶液制備含核酸樣品的方法
【專利說明】使用粘±礦物和堿性溶液制備含核酸樣品的方法
[0001] 政府權益聲明
[0002] 本文所述的工作由美國陸軍醫學研究購置活動化S.ArmyMedicalResearch AcquisitionActivity)撥款提供部分資金，合同號為W81XWH-10-2-0158。美國政府對本 發明享有一定的權利。 柳的]背景
技術領域
[0004] 本發明一般地設及用于處理樣品的方法，所述樣品用于分子診斷應用。
[OCX)日]相關技術描述
[0006] 許多診斷、研究、和研發程序需要檢測生物樣品中存在的特定核酸值NA或RNA)序 列。例如，核酸檢測方法用于鑒別細菌、病毒、或其它微生物，它們的存在可W說明感染性疾 病的原因。核酸生物標志物是幾種對全球衛生有高度重要性的感染性疾病，包括人免疫缺 陷病毒化IV)、丙型肝炎病毒（HCV)、乙型肝炎病毒（皿V)、流行性感冒、和登革熱的目標分 析物。更復雜樣本，例如人組織的樣品的測試也越來越普遍，其目的是確定與癌癥或遺傳病 相關的突變的存在。生物組織，例如從犯罪現場直接采集的血液中的核酸的檢測，也被用于 確定作為樣品來源的個體的身份，如，例如，親子鑒定或法醫分析。
[0007] 在核酸分子可W進行上述所說的任何目的的檢測之前，必需使生物材料樣品中的 特定的感興趣核酸達到可用的狀態。從生物樣本中釋放核酸的過程在本領域中通常被稱為 "樣品制備"。祀核酸常常被包含在病毒顆粒、細菌細胞、真菌細胞、或更復雜的生物體的細 胞，例如人白細胞內。
[0008] 在樣品制備過程中，細胞或病毒顆粒可W進行化學或酶學處理W使膜和蛋白質包 膜溶解或變性，從而導致核酸的釋放。運種溶解過程通常被稱為"裂解"，所得到的含有運種 裂解物質的溶液被稱為"裂解物"或"提取物"。可惜地是，運種釋放使核酸暴露，會受到樣 品中存在的內源核酸酶的降解，所述內源核酸酶存在的豐度可W使得在核酸釋放之后立即 開始降解。在后續純化過程中殘余的任何核酸酶都可W繼續降解完整的核酸，導致祀分子 從樣品中消失。核酸酶在大多數生物樣品中都是高豐度的，并且通常極能抵抗已知使其它 酶失活的處理。特別是，核糖核酸酶（RNases)即使不是在所有的生物樣品中，也是在大部 分生物樣品中是有活性的，特別是血液，而血液是最常收集的用于診斷目的的組織。除了核 酸酶之外，許多其他蛋白質和污染物常常存在于生物樣品中，和/或在裂解物的制備過程 中被釋放。例如，血液樣品可W包括血紅素和肝素（在抽血過程中使用的一種抗凝劑），它 們干擾和/或抑制許多下游的分析步驟。
[0009] 為了克服生物裂解物中存在的核酸酶和其它不希望的產物的問題，有必要設計復 雜的具有失活酶W及進一步純化核酸二者的方案。例如，陰離子去垢劑和離液劑，例如硫氯 酸脈，已被用于在從細胞和亞細胞結構中釋放核酸的同時失活或抑制核酸酶活性。為了進 一步從裂解物中純化核酸，本領域中通常是使用低分子量的醇類使核酸從溶液中沉淀。由 于在運些條件下，其它大分子也會沉淀，產生包裹著核酸的粘性的、難處理的物質，在進行 乙醇沉淀之前常常必需借助于含有酪、和/或氯仿的危險有機溶劑混合物來提取樣品。
[0010] 在制備用于RNA分析的樣品中的另外一個挑戰是保護運些不穩定分子的完整性。 不像DNA，RNA非常易于水解。因此，雖然可W在嚴格的條件下從生物樣品制備含DNA的裂 解物，用于RNA分析的樣品的制備通常需要使用穩定劑、核酸酶抑制劑和冷藏和/或冷凍。 兩種方法的變形形式曾被用于制備來自生物樣品的RNA:化學提取和固定在玻璃上，通常 被稱為"固相提取"。如上所述，化學提取通常使用高度濃縮的離液鹽和酸性酪或酪-氯仿 溶液來使RNases失活，并從其它生物分子中純化RNA。運些方法提供了非常純的RNA制備 物；但是，通常必須用醇沉淀步驟對RNA進行脫鹽和濃縮。固相提取方法，在Boometal的 美國專利No. 5, 234, 809中描述，依賴于離液試劑硫氯酸脈的裂解和核酸酶失活特性，W及 運種試劑存在時的固態二氧化娃顆粒或娃藻類的核酸結合性質。用含有乙醇的高鹽緩沖液 洗涂與二氧化娃結合的RNA之后，在低離子強度的緩沖液中洗脫RNA。
[0011] 容易理解，需要使用有機溶劑或離液劑進行水相提取的樣品制備方法是冗長的、 危險的、勞動強度大的、和速度慢的。而且，如果在進行運些程序的時候沒有特別小屯、，可能 發生核酸酶的殘余污染，樣本核酸會被降解或消失。用運種樣品進行的診斷測試可能由于 運種降解而給出假陰性結果。假陰性結果還可W由于化學干擾造成，例如來自于殘留的陰 離子去垢劑、離液鹽、或樣品中殘余的并且會抑制祀序列擴增程序的乙醇。如果已經使用了 陰離子去垢劑和蛋白酶，殘余的蛋白水解活性也可能降解祀序列擴增和/或雜交檢測反應 中使用的酶，并產生假陰性結果。在'809專利中公開的基于"爆轟裂解度oomlysis)"方 案的樣品制備方法通常被認為是充分應對了運些問題。但是，本發明人出人意料地發現，運 些提取方法，即使用離液鹽結合固相提取，在制備用于皿V基因組的WPCR為基礎的檢測的 血液或血漿樣品時，并不總是有效的。因此，上述的方案均不適于從復雜生物起始材料，例 如全血或血清中制備用于同時檢測DNA和RNA祀序列的通用樣品。運對于在臨床實驗室條 件下和在資源缺乏地區的傳染病診斷來說的是千真萬確的，在臨床實驗室條件下對時間的 要求非常高，在資源缺乏地區，成本效益、減少有毒廢物流和簡易性也很重要。
[0012] 雖然在該領域取得了進展，在本領域中仍然存在不同樣品核酸的提取和含核酸溶 液的制備方法的需要。本發明滿足了運些需要并進一步提供了相關的益處。 陽〇1引發明簡述
[0014] 本發明的實施方案提供樣品制備方法，所述方法克服了已知過程的缺陷。特別地， 本發明的實施方案的目的是提供樣品制備方法，所述方法使得能夠同時檢測來自普通樣 品，例如生物樣品的DNA和RNA祀。本發明提供了前所未有的快速的、簡單的、和可再現的 方法，W提供無損傷狀態的并且具有低污染風險的核酸，W使得運種樣品可W被立即用作 診斷分析中的試劑。本發明的實施方案是基于運樣的樣品制備方法，其中樣品在提取或裂 解之前用粘±礦物進行處理。然后，用堿性溶液處理樣品，W從含有感興趣核酸的細胞或病 毒顆粒釋放核酸（"堿裂解"）。
[0015] 本發明人令人驚訝地發現，用粘±礦物對樣品（例如生物樣品）進行預處理保護 核酸分子，特別是RNA，在堿裂解過程中不被水解。根據本發明方法的粘±礦物的使用還保 護核酸不發生核酸酶介導的降解。有利地，發現組合使用粘±礦物和堿溶液的方法使得含 核酸樣品的制備不含抑制酶和/或降解酶和/或其它污染物，其足W使得該樣品可W直接 用于檢測測定，例如核酸擴增程序，而無需任何進一步的純化步驟。因此，本發明的實施方 案提供快速的、簡單的、和相對無危險的復雜生物樣品制備方法，所述復雜生物樣品用于同 時檢測感興趣的DNA和RNA分子。本發明還特別適合于微型化，并且與自給式"忍片實驗 室"微流體盒和其它診斷測試試劑盒和裝置兼容。相應地，一些實施方案設及在微流體環境 中，例如在微流體卡上實施所公開的方法。
[0016] 本發明人令人驚訝地發現當基于堿裂解的方法包括用粘±礦物對樣品進行處理 時，運種方法可用于制備用于核酸分析的復雜生物樣品。本發明的方法可有利地用于制備 普通樣品，所述普通樣品用于同時檢測DNA和RNA祀分子。本發明的方法相對于已知的樣 品制備方法提供了改進，所述改進在于本發明的特定實施方案不需要在檢測前進一步純化 或分離核酸。不受理論的束縛，相信粘±礦物提供幾種有益效果，包括，但不限于，保護核酸 在堿性條件下不被水解；保護核酸不發生核酸酶介導的降解；保護下游測定試劑，例如DNA 聚合酶不受測試樣品中存在的抑制劑和其它污染物影響；W及常規的緩沖性質。根據本發 明制備的核酸樣品基本不含核酸酶活性，并且在用于修飾酶的時候是優選的底物。本文公 開的樣品制備方法在制備用于同時檢測DNA和RNA病毒的血液或血清樣品的制備上是特別 有利的。本發明的主要實施方案的主要特征在下文中總結。本發明的其它不同目的和益處 將會隨本發明的詳細描述和本文提供的實施例而顯而易見。
[0017] 在一個實施方案中，本發明設及處理用于核酸分析的含核酸樣品的方法。該方法 包括使樣品與粘±礦物接觸，使樣品與粘±礦物混合直至粘±礦物均勻分散在樣品中，從 樣品中基本上除去粘±礦物，使樣品與堿性溶液在適合于細胞和病毒顆粒裂解的抑下接 觸，W形成核酸溶液，W及，可選地，使核酸溶液與適合于中和核酸溶液的抑的酸性溶液接 觸。在前述的一些實施方案中，樣品是生物樣品，例如含有生物樣品的溶液。
[0018] 附圖簡述
[0019] 圖1顯示了定量PCR分析，W檢測樣品中皿VDNA，所述樣品是對含皿V病毒顆粒 的人血漿進行提取產生的，其依據的方案是基于堿裂解。
[0020] 圖2顯示了定量PCR分析，W檢測樣品中MS2RNA，所述樣品是對含有MS2RNA的人 血液進行提取產生的，其依據的方案是基于用粘±礦物進行處理，然后進行堿裂解。
[0021] 圖3顯示了定量PCR分析，W檢測樣品中MS2RNA，所述樣品是對含有MS2顆粒的人 血漿進行提取產生的，其依據的方案是基于用粘±礦物進行處理，然后進行堿裂解。
[0022] 圖4顯示了定量PCR分析，W檢測樣品中HCVRNA，所述樣品是對含有HCV顆粒的 人血液進行提取產生的，其依據的方案是基于用粘±礦物進行處理，然后進行堿裂解。 陽02引 圖5顯示了定量PCR分析，W同時檢測樣品中的皿VDNA和肥VRNA，所述樣品是 對含有皿V和HCV顆粒的人血液進行提取產生的，其依據的方案是基于用粘±礦物進行處 理，然后進行堿裂解。