在被孢霉屬微生物內顯示高表達活性的啟動子的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明提供在被抱霉（Modierella)屬微生物細胞內顯示高表達活性的啟動子、 含有該啟動子的載體、導入了該啟動子的非人轉化體W及使用該啟動子或轉化體的蛋白 質、脂質或脂肪酸的制造方法。
【背景技術】
[0002] -直W來開發并實用化了通過微生物代謝來生產有用化合物的技術（廣義的發 酵技術）。例如，高山被抱霉（Mcxrtierellaalpina)等被抱霉屬的菌類，是已知的生產W花 生四締酸為主的高度不飽和脂肪酸（PUFA)且在工業上特別有用的菌類（專利文獻1)。 在利用運種菌類方面，已做了育種工作，即把有用生物的遺傳性改良為更理想的特性 (進行品種改良）。尤其在發酵技術中，從提高由微生物生產有用化合物的生產效率W及降 低該化合物的制造成本等的觀點出發，育種已變得非常重要。 為了培育具有更優選特性的有用生物，已利用了介由轉化的方法。運種情況下，為了獲 得目標性狀，將編碼必需蛋白質的DNA片段導入到想要培育的有用生物（宿主）中，W使其 在適當的基因啟動子的控制下進行表達，從而獲得轉化體集團。此后，從中篩選理想的品種 (菌株）。此時，適應于成為宿主的生物種且適應于想要改變的特性的恰當的基因啟動子是 必需的。 關于屬于被抱霉屬的菌類的絲狀菌的轉化方法，已有多種技術被報導。另外，已獲得了 多種與被抱霉屬菌類的脂質生產能力相關且參與脂質合成系統的酶基因。然而，針對用于 將運些有用的酶基因導入被抱霉屬內，并使之W高水平表達的必需的基因啟動子，至今幾 乎未報導。 現有技術文獻 [000引專利文獻 專利文獻1日本國特開昭63-044891公報
【發明內容】
[0004] 在如上所述的狀況下，尋求高效地生產有用脂質的菌株的育種，為此，適于被抱霉 屬的菌類的基因啟動子必不可少。
[0005] 本發明者不斷深入研究的結果，成功克隆了在高山被抱霉（Ealpina)中高表達 的基因的啟動子，從而完成了本發明。即本發明提供W下多核巧酸、表達載體、轉化體、使用 該多核巧酸W及轉化體的蛋白質、脂質或脂肪酸的制造方法。
[0006] 具體而言，本發明如下。
[1] 一種多核巧酸，其特征在于，是選自W下（a)~（C)中的任意一項所述的多核巧 酸： (a)多核巧酸，其含有選自序列號1~28中的任意一個的堿基序列； 化）多核巧酸，其含有相對于選自序列號1~28中的任意一個的堿基序列有90%W上 的同一性的堿基序列，且在屬于被抱霉屬的微生物細胞內顯示啟動子活性；w及 (C)多核巧酸，其為與由選自序列號1~28中的任意一個的堿基序列的互補堿基序列 組成的多核巧酸在嚴謹條件下雜交的多核巧酸，且為在屬于被抱霉屬的微生物細胞內顯示 啟動子活性。 凹根據山所述的多核巧酸，其特征在于，所述啟動子活性是指在屬于被抱霉屬的微 生物細胞內表達GUS報告基因時，至少500nmol/(mg?分鐘）的GUS蛋白質活性被確認。
[3] 根據[1]所述的多核巧酸，其特征在于，含有選自序列號1~28中的任意一個的堿 基序列。
[4] 根據[1]或[2]所述的多核巧酸，其特征在于，為DNA。
[引一種載體，其特征在于，含有[1]~[4]中任一項所述的多核巧酸。
[6] -種非人轉化體，其特征在于，導入了 [1]~[4]中任意一項所述的多核巧酸。
[7] -種非人轉化體，其特征在于，導入了 [引所述的載體。 閒根據[7]或閒所述的轉化體，其特征在于，所述轉化體為脂質生產菌。
[9]根據[引所述的轉化體，其特征在于，所述脂質生產菌為高山被抱霉（Modierella 曰Ipin曰）D
[0007] 將本發明的多核巧酸用作啟動子時，可使目標基因在屬于被抱霉屬的微生物細胞 內高效表達。
【附圖說明】
[0008] 圖1是表示用于評價本發明的啟動子的載體的例子的圖。將化sP序列替換為本 發明的啟動子而使用。 圖2是表示用各種培養基（灰色柱：GY培養基，白色柱：大豆粉培養基）培養由本發明 的啟動子序列轉化的轉化體時的啟動子活性的圖。用10ml各培養基在28°C、300rpm下培 養5天。 圖3是表示啟動子GAL10-化的活性的圖。表示通過半乳糖添加而誘導的啟動子活性。 圖4是表示啟動子PP7p及其截短型啟動子的活性的圖。用10mlGY培養基在28°C、 300巧m下培養5天。 圖5是表示啟動子CITlp及其截短型啟動子的活性的圖。用10mlGY培養基在28°C、 300巧m下培養3天。 圖6是表示啟動子PP化及其截短型啟動子的活性的圖。用10mlGY培養基在28°C、 300;rpm下培養10天。 圖7是表示啟動子PP化及其截短型啟動子的活性的圖。用10mlGY培養基在28°C、 300巧m下培養5天。 圖8是表示啟動子服C8化及其截短型啟動子的活性的圖。用lOmlGY培養基在28°C、 300巧m下培養5天。 圖9是表示啟動子SSA化及其截短型啟動子的活性的圖。用10mlGY培養基在28°C、 300巧m下培養5天。 圖10是表示啟動子GA巧及其截短型啟動子的活性的圖。用10mlGY培養基在28°C、 300巧m下培養5天。 圖11是表示啟動子GALIO-化及其截短型啟動子的活性的圖。 圖12A是表示源自大腸桿菌巧.coli)的GUS基因（CDS序列：序列號29,氨基酸序列： 序列號30)與將源自大腸桿菌的GUS基因的密碼子的使用變為被抱霉屬的微生物用的GUSm 基因仰S序列：序列號31，氨基酸序列：序列號32)的比對圖。 圖12B是圖12A的繼續。
【具體實施方式】
[0009] W下詳細說明本發明。W下的實施方式是用于說明本發明的例示，并不意味著將 本發明僅限于此實施方式。本發明只要不脫離其主旨，可W各種方式實施。 另外，本說明書中引用的全部文獻及公開公報、專利公報、其它專利文獻已作為參照編 入本說明書中。此外，本說明書包含2013年3月27日申請的成為本申請優先權主張的基 礎的日本國專利申請（特愿2013-066265號）的說明書及圖面中所述的內容。
[0010] 本說明書中在未特別記載的情況下，堿基序列記載為5'末端在左側，3'末端在右 側。
[0011] 1.啟動子 如后述實施例中的詳細記載，本發明者首次成功地從作為脂質生產菌的M.alpina中 克隆了多種啟動子序列。此外，本發明者也確認了由運些啟動子表達的蛋白質顯示其生物 活性。 本發明的啟動子為PP7p、Cmp、PP3p、PP化、PP6ps、服C8化、SSA化、GAL10-化和/或 它們的部分序列（截短型）。運些啟動子區序列及其截短型序列示于下表。 W下，將上述表格中所示堿基序列即選自序列號1~28中的任意一個序列統稱為"本 發明的啟動子序列"。
[001引[表U表1
[0013] 在此，作為在屬于被抱霉屬的微生物細胞內顯示高表達活性的啟動子，本發明提 供W下多核巧酸。 選自W下（a)~（C)中任意一項所述的多核巧酸： (a)多核巧酸，其含有本發明的啟動子序列； 化）多核巧酸，其含有相對于本發明的啟動子序列有90%W上同一性的堿基序列，且 在屬于被抱霉屬的微生物細胞內顯示啟動子活性；W及 (C)多核巧酸，其為與由本發明的啟動子序列的互補堿基序列組成的多核巧酸在嚴謹 條件下雜交的多核巧酸，且為在屬于被抱霉屬的微生物細胞內顯示啟動子活性的多核巧 酸。
[0014] W下，將上述（a)~（C)中記載的多核巧酸稱為"本發明的多核巧酸"。 另外，本發明中，"含有"本發明的啟動子序列是指"包含"本發明的啟動子序列。因此， 本發明的啟動子序列W外的附加的序列，例如增強子序列等也可附加在本發明的啟動子序 列的上游（5'末端側）或下游（3'末端側）。運樣的附加的序列可在與本發明的啟動子 序列之間介由1~l〇〇〇bp、l~900bp、l~800bp、l~700bp、l~600bp、l~500bp、l~ 400bp、l~300bp、l~200bp、l~100bp、l~75bp、l~50bp、l~25bp、l~lObp的堿基 序列進行附加，或者也可直接連接到本發明的啟動子序列上（即介于本發明的啟動子序列 與附加的序列之間的核巧酸殘基數為0)。
[001引本說明書中，"多核巧酸"是指DNA或RNA。 本說明書中，"在嚴謹條件下雜交的多核巧酸"是指，例如將由本發明的啟動子 序列的互補堿基序列組成的多核巧酸的全部或一部分作為探針，采用菌落雜交法、隧 菌斑雜交法或Southern雜交法等得到的多核巧酸。作為雜交的方法，例如，可利用 "Sambrook&Russell，MolecularCloning：ALaboratoryManualVol.3，ColdSpring Harbor，LaboratoryPress2001" 及"Ausubel，CurrentProtocolsinMolecular Biology,JohnWiley&Sonsl987-1997"等中所記載的方法。
[0016] 本說明書中，"高嚴謹條件"例如為（l)5XSSC、5XDenhar化溶液、0. 5%SDS、50% 甲酯胺、50°C，（2)0. 2XSSC、0. 1%SDS、60°C，（3)0. 2XSSC、0. 1%SDS、62°C，（4)0. 2XSSC、 0. 1%SDS、65°C，或巧)0. 1XSSC、0. 1%SDS、65°C的條件，但不限于此。在運些條件中，越提 高溫度越能期待高效地得到具有高序列同一性的DNA。但是，認為作為影響雜交的嚴謹度的 因素，有溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等多種因素，只要是本領域技術 人員，即可通過適當選擇運些因素來實現同樣的嚴謹度。
[0017] 另夕F，當使用市售的試劑盒進行雜交時，例如可W使用AlkphosDirect L油ellingandDetectionSystem(GEHealthcare)。此時，按照試劑盒中附帶的操作指南， 與標記的探針解育過夜后，在55°C的條件下使用含有0. 1% (w/v)SDS的最初的洗涂緩沖液 將膜洗涂后，即可檢測出雜交的DNA。或基于本發明的啟動子序列的互補堿基序列的全部 或一部分制備探針時，使用市售的試劑（例如，PCR標記混合物（羅氏診斷有限公司（Roche Diagnostics公司））等）將該探針進行地高辛值IG)標記的情況下，可使用DIG核酸檢測 試劑盒（RocheDia即ostics公司）來檢測雜交。
[0018] 作為除上述W外可雜交的多核巧酸，在通過FASTA、BLAST等同源性檢索軟件使用